酵母双杂交筛选小麦TaMBD2互作蛋白

为探讨小麦甲基结合域蛋白(TaMBD2)在植物生长发育过程中的调控功能,以TaMBD2基因的全长cDNA为模板,构建诱饵载体pGBKT7-TaMBD2,利用酵母双杂交系统从小麦cDNA文库中筛选TaMBD2互作蛋白。结果共筛选到91个菌斑显蓝色的克隆,对其进行菌液PCR检测并测序,然后在NCBI上进行BLAST比对分析,共获得8个可能与TaMBD2互作的蛋白,分别为二磷酸核苷激酶(NDPK)、ENTH结构域蛋白、SIAN蛋白、Agenet结构域蛋白、C2H2型锌指蛋白、磷酸激酶和2个假定蛋白,其中最有可能的TaMBD2互作蛋白为NDPK。这些候选蛋白主要参与细胞信号传导、抗逆、能量代谢和蛋白质运输等。其中,检测结果中参与植物抗逆胁迫的蛋白质为主要互作蛋白,所占比例为54.9%;参与蛋白质运输的互作蛋白所占比例为25.3%,其余互作蛋白所占比例较小。因此,推测TaMBD2可能主要参与植物对干旱、低温和高盐等非生物胁迫逆境的响应及调控。     

稻瘟病菌MoYpt7互作蛋白的初步筛选

利用酵母双杂交系统,以稻瘟病菌MoYpt7激活型为诱饵蛋白,从稻瘟病菌不同生长发育阶段的cDNA文库中筛选互作蛋白,经复筛得到10个候选互作蛋白基因,利用Bi FC或pull-down assay验证蛋白间的互作,为寻找MoYpt7下游调控侵染致病过程的效应因子提供依据.     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

ZmCIPK8互作蛋白CBLs的筛选

利用酵母双杂交技术,以PGBKT7-ZmCIPK8载体为诱饵质粒,筛选能与ZmCIPK8互作的CBLs蛋白.结果表明,ZmCBL1,4,9能够与ZmCIPK8相互作用.表达分析结果为进一步研究ZmCIPK8与ZmCBL1,4,9在植物体内的相互作用提供了又一证据,这为深入解析ZmCIPK8参与逆境胁迫的作用机制奠定了基础.     

小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

四季秋海棠BsMYB62基因酵母双杂交诱饵载体的构建及互作蛋白的筛选

[目的] 低温和高光均能引起四季秋海棠(Begonia semperflorens)叶片因合成积累花色素苷而变红.本研究从低温和高光处理四季秋海棠的转录组中筛选并克隆得到1个MYB转录因子基因并命名为BsMYB62 ,对其进行生物学信息分析,并从四季秋海棠cDNA文库中筛选出与其互作的蛋白.[方法] 设计BsMYB62...     

香蕉果实酵母双杂交文库的构建及后熟转录因子MaMADS2互作蛋白筛选

[目的]本文旨在鉴定香蕉果实后熟关键调控因子MaMADS2的互作蛋白,深入解析MaMADS2影响香蕉果实后熟过程的分子机制。[方法]以MaMADS2为诱饵利用酵母双杂交文库获得候选互作蛋白,通过克隆候选互作基因编码区进行点对点酵母双杂交试验来验证互作情况;利用转录组学分析互作蛋白相关基因在后熟过程中的表达情况;利用双分子荧光互补试验鉴定重要互作蛋白与MaMADS2的互作;最后用蛋白免疫印迹分析MaMADS2蛋白在香蕉后熟过程中的表达。[结果]成功构建了果实在乙烯利催熟下的cDNA文库,初级和次级文库的库容分别为2.9×10⁶和3.2×10⁶ CFU·mL^-1,平均插入片段大小在1 200 bp以上,可满足后续酵母双杂交筛选的要求。最终共鉴定出7个互作蛋白,其中有2个MADS-box转录因子,3个E3泛素连接酶,2个具有转录抑制作用的蛋白。转录组数据表明,乙烯利可抑制2个MADS-box基因的表达,而1-甲基环丙烯(1-MCP)对其表达起诱导作用。双分子荧光互补试验表明,MaMADS2与MADS-box转录因子Ma04＿p...     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

采用酵母双杂交系统筛选梨PbTMT4互作因子

为筛选梨糖转运相关蛋白PbTMT4互作因子,基于已经建立好的砀山酥梨果实发育时期的cDNA文库,利用Matchmaker~(TM) Gold酵母双杂交系统,以构建的重组质粒pDHB1-PbTMT4为诱饵质粒,采用PEG/LiAc法转化酵母菌株NMY51。利用表型筛选法检测PbTMT4的自激活作用和毒害作用,利用氨基酸缺陷型培养基筛选PbTMT4互作因子。结果表明,诱饵蛋白PbTMT4在酵母双杂交系统中无毒性和自激活作用。通过酵母双杂交筛选以及测序和序列比对分析,共获得13个与PbTMT4蛋白相互作用的宿主蛋白。     

拟南芥NBS1互作蛋白的筛选和鉴定

【目的】筛选拟南芥中NBS1的互作蛋白,探究NBS1蛋白的新功能,为后续研究奠定基础。【方法】利用酵母双杂交技术筛选拟南芥c DNA文库,对得到的序列进行BLAST比对、亚细胞定位分析和基因本体注释。【结果】共有221个阳性克隆,测序后通过BLAST比对得到97个与NBS1互作的蛋白,包括膜蛋白、转运蛋白和折叠蛋白等,它们主要定位于细胞质、细胞核和叶绿体等,主要富集于4个分子功能、5个细胞组分和13个生物过程。【结论】拟南芥中与NBS1互作的蛋白在刺激响应、信号转导和细胞代谢等方面发挥着重要作用,也证明NBS1是一种多功能蛋白,但其功能及分子机制还需进一步研究。     

酵母双杂交筛选与小鼠维生素D受体互作的蛋白

通过酵母双杂交实验技术筛选小鼠VDR相互作用的蛋白质,评价不同蛋白与VDR的结合活性,以期获得基于互作影响雄性生殖能力基因。扩增小鼠VDR完整CDS序列,克隆至诱铒表达载体pGBKT7,经菌落PCR、DNA测序鉴定,获得重组载体pGBKT7-VDR。随后将重组载体转化至酿酒酵母AH109,并进行毒性和自激活检测;然后与含小鼠cDNA文库的Y187酵母杂交,获得阳性克隆,经HindⅢ酶切,测序分析VDR互作候选蛋白的核酸序列,再检测β-半乳糖苷酶活性,评价候选蛋白与VDR作用力的强弱。结果表明,从小鼠cDNA文库中获得12个与VDR互作的候选蛋白。初步检测到12个蛋白可能与VDR互作,其中3个蛋白因子可能与VDR结合并调控蛋白激酶磷酸化或去磷酸化以影响精子形成、发育和精子活力。     

长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证

【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1 重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2 重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO 培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体蛋白激酶FTPK1的互作蛋白

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases, RLKs)作为重要的信号分子受体,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用,因此鉴定RLKs的底物蛋白对于其功能的研究至关重要。本研究利用酵母双杂交系统对FTPK1的互作蛋白进行筛选,初步确定了两个候选蛋白,为进一步研究该激酶的功能奠定了基础。     

水稻条纹病毒外壳蛋白自身互作的活性区段研究

水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)的外壳蛋白(coat protein,CP)参与病毒转录、复制等多个生物学过程。病毒蛋白之间的互作对病毒侵染活性非常重要,在明确RSV外壳蛋白CP能够自身互作的基础上,通过构建CP蛋白N端、M区段和C端(CP-N、CP-M和CP-C)的酵母表达载体,利用酵母双杂交系统确定外壳蛋白CP自身互作的活性区段。结果表明,N端和C端第1~81个氨基酸是参与水稻条纹病毒CP蛋白自身互作的活性区段。这一研究结果不仅有助于加深理解RSV CP蛋白在病毒基因组稳定、复制过程中的作用,也有助于加深了解RSV、寄主和传播介体之间关系。     

红肉苹果MdMKK9互作蛋白的筛选与鉴定

MKK9是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族重要成员之一,是在植物细胞响应外界胁迫信号转导中发挥重要作用的酶。为深入研究苹果MKK9的相关功能,以红肉苹果‘黛红’为材料,克隆到MdMKK9基因CDS序列,利用酵母双杂交试验筛选苹果cDNA文库,并通过酵母双杂交筛选、体内双分子荧光互补(BiFC)和体外Pull-down试验进行MdMKK9互作蛋白验证。结果表明,通过对苹果cDNA文库的筛选,共获得11个参与调控植物生长发育及应答逆境胁迫的候选互作蛋白;选取花青苷合成相关蛋白MdCHS及氮胁迫调控相关蛋白MdSPX3进行酵母双杂交、体内BiFC及体外Pull-down试验,结果证明MdMKK9可与MdSPX3互作。     

拟南芥转录因子AtMYB73转录活性区域分析及互作蛋白的筛选

【目的】确定拟南芥抗逆转录因子AtMYB73的转录活性区域并筛选获得与其互作的蛋白,为进一步阐明AtMYB73调控拟南芥抗逆的分子机制奠定基础。【方法】构建转录因子AtMYB73的酵母诱饵表达载体pAS1-AtMYB73,检测pAS1-AtMYB73的自激活性及其对酵母Y190的细胞毒性。克隆AtMYB73的N端区域（含有R2R3结构域）和C端区域（不含R2R3结构域）,检测AtMYB73的N端和C端的转录激活活性,分析AtMYB73自激活结构域的位置。利用酵母双杂交技术,以AtMYB73为诱饵筛选拟南芥的cDNA文库,将阳性克隆进行鉴定、测序;利用TAIR数据库对筛选获得的AtMYB73的候选互作蛋白进行分析。构建AtMYB73和F12F1.4的酵母双杂交载体pGBDT7-AtMYB73和pGADT7-F12F1.4,通过酵母双杂交技术,对其互作关系进行分析。【结果】含pAS1-MYB73的酵母菌在不同浓度的3-AT的SD/-His/-Trp/、SD/-Ade/-Trp培养基上均能生长,表明AtMYB73具有较高的自激活活性。含pAS1-AtMYB73的酵母菌在SD/-Trp/Amp液体培养基中培养24 h的OD₆₀₀值大于0.8,表明诱饵载体对酵母Y190没有细胞毒性。成功构建了pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C载体,获得了含有pAS1-AtMYB73-N和pAS1-AtMYB73-C的酵母;含pAS1-AtMYB73-N的酵母在含X-a-gal的YPAD培养基上呈现无色,而含pAS1-AtMYB73-C的酵母则呈现蓝色,表明AtMYB73的C端有明显的自激活性,而N端没有自激活性。以AtMYB73为诱饵,筛选拟南芥的cDNA文库,获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个蛋白。利用酵母双杂交技术,确定了MYB73与F12F1.4之间存在一定的互作。【结论】拟南芥抗逆转录因子AtMYB73具有较高的转录激活活性,其活性区域位于C端;以AtMYB73为诱饵,筛选获得了与光合作用、防御反应途径、抗逆等相关的8个AtMYB73的候选互作蛋白;利用酵母双杂交技术,确定了AtMYB73与F12F1.4之间的互作关系。     

大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。     

利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子,在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒（RGSV）沉默抑制子P5互作的寄主蛋白,为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础,为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因,将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中,通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-LeuTrp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中,先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/...     

利用酵母双杂交系统筛选玉米ZmPRR73的互作蛋白

为了阐明ZmPRR73基因的生物学功能,构建诱饵表达载体pGBKT7-ZmPRR73,利用酵母双杂交技术,从长日照光照环境诱导的热带玉米自交系的cDNA文库中筛选与ZmPRR73互作的蛋白。结果显示：构建的诱饵载体pGBKT7-ZmPRR73对酵母菌株无毒性,且对报告基因无自激活活性,共鉴定出12个与ZmPRR73互作的候选蛋白。生物信息学分析表明,这些候选互作蛋白的功能涉及植物的转录调控、离子跨膜转运的调节、信号转导、电子传递链等多个方面,推测ZmPRR73蛋白与以上蛋白互作参与多个信号转导和代谢途径,研究结果补充和完善了ZmPRR73蛋白参与的调控途径,为进一步研究生物钟核心元件ZmPRR73的分子功能提供了新的分子证据。