卡那霉素筛选小麦转基因后代方法的优化

[目的]优化卡那霉素筛选小麦转基因后代的方法。[方法]以普通去离子水和0.5×Hoangland营养液为卡那霉素(Kan)的溶解介质,对Kan的浓度进行多梯度筛选,确定Kan的最低有效浓度,并针对不同小麦基因型材料进行验证。[结果]0.5×Hoangland营养液是Kan的理想溶解介质,既降低了Kan对小麦幼苗生长的抑制作用,又提高了Kan的筛选效果。30 mg/L是Kan作用于小麦NC221的最低有效浓度。不同小麦基因型对Kan的敏感性稍有不同,对大多数小麦基因型来说,Kan的最低有效浓度为30~45 mg/L,即在该浓度范围内进行处理可除去90%的未转基因植株。[结论]0.5×Hoangland营养液作溶解介质时,Kan用于筛选小麦转基因后代的最低有效浓度为30~45 mg/L。     

卡那霉素筛选转基因小麦种子关键技术研究

对影响小麦卡那霉素筛选效果的培养基质和药剂处理方式进行了比较研究.结果表明:在种子吸胀阶段进行充分有效的卡那霉素浸种处理是提高卡那霉素筛选效果的关键技术;种子不经卡那霉素溶液浸种吸胀而直接在蛭石基质上,或用水浸种吸胀后再在蛭石等培养基质上进行卡那霉素处理,会降低小麦卡那霉素抗性筛选的效果.小麦种子幼苗的卡那霉素筛选,可用100 mg/L卡那霉素浸种至露白后再放到装有蛭石的培养皿上浇水即可,不需要再浇卡那霉素溶液.     

卡那霉素在筛选转基因番茄后代中的应用

以中蔬5号番茄种子为试验材料,进行卡那霉素梯度浸种试验,确定卡那霉素筛选的最佳浓度,在此基础上,用浸种法、浇灌法、叶片涂抹法和叶盘培养法4种方法对T1转基因番茄植株(含有nptⅡ基因)进行筛选。同时用PCR检验叶片涂抹法和叶盘培养法的筛选准确性。结果显示,卡那霉素的最佳筛选浓度为100 mg/L;叶片涂抹法和叶盘培养法较适合大规模的筛选,根据PCR验证结果,两种方法的准确度可达90%。     

卡那霉素筛选转基因棉花技术研究

为了提高带有npt-Ⅱ标记基因的转基因棉花后代的筛选效率,通过利用不同浓度的卡那霉素溶液进行浸种,同时比较浸种时间的长短对棉花子叶片伤害程度,并用PCR分子检测相互验证。结果表明:用浓度1 000 mg/L的硫酸卡那霉素溶液浸种3 d,每5 mL溶液浸泡1粒棉花种子,播种出苗以后,拔除子叶上有白化斑的棉花苗,剩余的子叶上没有出现白化斑的棉花苗即为转基因阳性植株,经PCR检测筛选的准确率达100%。利用卡那霉素溶液浸种的方法筛选带有npt-Ⅱ标记基因的转基因棉花后代材料的技术流程经济有效、准确可行。     

转基因玉米抗卡那霉素筛选方法研究

为了建立简单有效地筛选抗卡那霉素标记基因玉米的方法,分别用玉米自交系"昌7-2"和杂交种"郑单958"为试验材料,用不同浓度、不同体积的卡那霉素溶液分别浸种3、4 d后播种,调查播种10 d后的玉米幼苗白化率,确定玉米对卡那霉素的抗性,结果表明用卡那霉素浸泡玉米种子,玉米苗的白化率不但与卡那霉素浓度有关,而且与浸种的用液量有关,杂交种和自交系之间差异并不大,利用100 mL浓度为200 mg/L的卡那霉素溶液浸种3 d后播种,白化苗率基本可以达到100%,用100 mL浓度为150mg/L的卡那霉素溶液浸种20粒种子3 d后播种进行抗性筛选,经过对玉米T1代转基因植株的筛选试验进行验证准确度达到了84.8%,表明该方法可行,可作为筛选玉米转化抗卡那霉素标记基因的一种简便方法。     

利用卡那霉素筛选烟草转基因植株的技术研究

待供试材料转基因和非转基因云烟87烟株长至5~7片叶时,在第3片叶上连续5 d喷施400 mg/L的卡那霉素溶液,喷后2 d观察,结果非转基因云烟87烟株叶片全部产生黄色斑点,而带有卡那霉素抗性标记基因的转基因云烟87烟草叶片表现正常。利用此方法对转基因烟草T2代3个株系进行筛选,筛选出22株转基因烟草植株,并用PCR方法对此方法的准确性进行了验证,结果表明,此方法对转基因烟草是一种简单快速的筛选方法。     

棉花转基因工作中利用卡那霉素筛选试管再生株的研究

在转棉花不育基因工作中，利用kanamycin(简称KM）筛选携带有NPTⅡ基因的棉花试管再生株，其结果基本与大田涂抹除草剂结果一致，对于大量转化后代，用此方法比常规直接将试管再生株移入大田后再进行检测更为方便，而且减轻试验室的工作量，节省试验成本，节约试验空间，减少移入大田的非转化体的数量。     

茎尖转化法转基因小麦后代的遗传特性分析

为了探讨农杆菌转化微创芽生长点法获得的转基因小麦后代的遗传特性,以3个世代的转基因小麦后代为材料,通过抗性筛选、PCR和PCR-Southern blot等方法分析外源基因遗传在T_2、T_3、T_4中的遗传分离情况。结果表明:T_2代33个株系中外源基因完全丢失的株系占61%,其余39%的株系能够检测到外源基因,但分离比例分散偏离了孟德尔遗传分离规律;T_3代42个株系中检测不到外源基因的株系占55%,能检测到外源基因但分离比例复杂的株系占43%,符合孟德尔分离定律占2%;T_4代8个株系中检测不到外源基因的株系占25%,能检测到外源基因但分离比例复杂的株系占50%,转基因植株与非转基因植株的分离比例符合孟德尔分离定律占25%。可见,利用农杆菌转化微创芽生长点法获得的转基因小麦后代中,外源基因丢失的比例较高,转基因植株与非转基因植株的分离多不符合孟德尔分离比例,但随着世代的增加,外源基因遗传稳定性有所提高。     

医用卡那霉素在转基因抗虫棉鉴定中的应用

利用医用硫酸卡那霉素对不同品种的棉花叶片进行处理,研究不同浓度医用硫酸卡那霉素溶液、不同棉花品种叶片对卡那霉素处理的外观变化。结果表明:不同棉花品种叶片对卡那霉素处理呈相同的变化趋势。当卡那霉素浓度达到5 000 mg/L时,检测准确度最好。     

花粉管通道法转基因棉花后代筛选鉴定

通过对棕色棉BC05叶片进行Kan浓度梯度涂抹实验,确定了Kan涂抹筛选的最佳浓度为3.0 g/L,最佳观察时间为涂抹第5天。对Kan抗性植株进行PCR鉴定表明,Kan涂抹筛选可基本准确的鉴别出转基因材料与非转基因材料,但目标基因是否成功整合还必须进行PCR鉴定,田间卡那霉素筛选结合PCR分子鉴定是转基因棉花后代大规模群体筛选的有效方法。     

小麦育种工作40年回顾Ⅱ.杂交育种的亲本选配和后代处理

根据已定育种目标，着眼近期，考虑长远的需要，采取不同亲本选配方式。后代处理中既要考虑遗传因素，还要考虑生态、生理因素影响     

Screening Method for Transgenic Maize with Kanamycin Resistance

[Objective]The paper was to establish simple and effective method to screen marker gene in maize with kanamycin resistance.[Method]Using inbred line "Chang 7-2" and hybrid "Zhengdan 958" of maize as test materials,their seeds were soaked with different concentrations and volumes of kanamycin for3 and 4 d,respectively,the rate of albino seedlings and average seedling height after sowing for10 d were investigated.[Result]The rate of albino seedlings not only was related to kanamycin concentration,but also had relationship with solution volume during soaking process.The difference between inbred line and hybrid was no significant.When 100 ml of kanamycin solution with concentration of 200 mg/L was used to soak seeds for 3 d,the rate of albino seedlings basically could reach 100%.When 100 ml of kanamycin solution with concentration of 100 mg/L was used to soak 20 seeds for 3 d to carry out resistance screening,the accuracy was up to 84.8% after verifying the screening test of T1 transgenic maize plants.[Conclusion]The method was feasible,which could be used as a simple method for screening transgenic gene maize with kanamycin resistance.     

植物组织培养在作物新品种选育与后代繁育上的应用

随着科学技术的不断创新,植物组织培养作为一项发展已久的生物技术,近年来发展异常迅猛。由于其生长周期短、成活率高、工厂化生产和农村现代化发展管理水平高等优点,这项技术已被广泛应用于现代农作物生产中,成为中国现代化农村发展的关键技术之一。鉴于此,本文重点围绕植物组织培养技术在农业方面与基因工程、原生质体与体细胞杂交、倍性育种、种质资源保存和作物脱毒、离体培养等方面的应用展开论述,着重探讨组培技术在作物育种方法与后代繁殖上的应用现状及它们各自解决的生产难题,并简单介绍组培技术结合环境控制的应用,为后续农业生产提供参考。     

以nptⅡ为选择标记基因的转基因小麦高效筛选方法

采用两种方法筛选以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦植株,结果表明,由未成熟种子获得的植株在无菌条件下进行卡那霉素筛选时（A方法）,50 mg/L的卡那霉素能有效抑制非转化小麦幼苗的正常生长;由成熟种子自然发芽获得的植株在滤纸上进行卡那霉素滴注筛选时（常规方法,B方法）,80～100 mg/L的卡那霉素能较好地抑制非转化小麦幼苗的正常生长。相对于B方法的常规筛选方法,A方法具有材料对卡那霉素敏感性高、筛选周期短而且筛选结果可靠性高等优点,是一种高效的以npⅡt为选择标记基因的转基因小麦的筛选方法。     

Regular Production of Transgenic Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens

Wheat is the number one crop both in acreage and total yield in the world. Therefore, it is very important to improve wheat by gene engineering techniques even though it belongs to the plants insensitive to gene transformation, especially to Agrobacterium-mediated transformation. Wheat immature embryos of 1.0-1.5mm in size, C58c1 of Agrobacterium strain harboring pPTN249, pPTN270, pPTN254, and pSIS-GFP respectively (all the vectors contain the aphA selectable gene driven by enhanced 35S promoter and a target gene controlled by ubi promoter or E35S promoter), AB medium for Agrobacterium activate culture, WCC medium for co-culture, were used in this study. The embryos with 4 days of pre-culture were transferred onto selection medium with 10mg/L geneticin, 50mg/L ticarcillin, 50mg/L vancomycin, and 50mg/L cefotaxine after 30 minutes of infection and 2 days of co-cultivation with Agrobacterium. Followed callus production,shoot regeneration on selection medium, 114 resistant plantlets were obtained from 10 transformation experiments of four genotypes. By nptⅡ ELISA (nptⅡ enzyme assay), PCR, Southern blot and leaf bleach,29 positive plants were identified from two genotypes of Bobwhite and Yanglmai 10, with an average transformation efficiency of 0.82 %. The result tested by Southern blot also showed that the transgenic plants with single- copy integration of target gene took 65.52% among total positive plants. The ELISA value of transgenic plant was also related to the copies of alien DNA integrating into wheat chromosomes, the transgenic plants with single copy integration giving higher ELISA value than the ones with 2 or 3 copies integration.     

转基因拟南芥株系后代遗传稳定性鉴定

转基因材料的遗传稳定性是基因工程成败的关键内容之一,快速确证其多代遗传特性是进行大量后代材料分析的技术保证。该文主要利用PCR技术以提取出的DNA作为模板对外源基因进行扩增,从而鉴定外源基因的遗传特性。对提取出的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析,实验结果表明,提取出的DNA产量和质量较高,PCR的结果快速确证了转基因拟南芥外源ADH1基因的遗传稳定性。     

转基因技术在小麦遗传改良中的应用

概述了自第一株转基因小麦问世以上转基因小麦研究取得的巨大进展,简要介绍了基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法等基因转化方法,对转基因技术在获得抗除草剂、抗病虫、抗逆、改良品质和雄性不育转基因小麦植株等方面的应用情况进行了回顾,指出了转基因小麦研究中存在的主要问题,展望了转基因小麦前景。