杏鲍菇漆酶基因DNA片段的克隆及序列分析

参照Genbank中发表的杏鲍菇漆酶基因序列(No.AY686700),并根据真菌漆酶氨基酸序列保守区设计特异性引物。以杏鲍菇基因组DNA为模板,PCR扩增出长2 606 bp的漆酶基因片段,DNA经纯化后克隆到pGM-T载体上,经筛选、PCR鉴定和序列分析,证明该片段为完整的杏鲍菇漆酶基因(Genbank注册号KC789846)。通过对基因序列的内含子/外显子进行预测分析,获得漆酶编码区的cDNA,该基因的开放阅读框由1 596个核苷酸组成,编码一个由531个氨基酸组成的多肽,分子量大小约为56 682.0,等电点pI为4.56;比对结果发现该基因氨基酸序列与其他真菌漆酶的同源性最高达93%;进一步对X22-12漆酶二级结构进行分析,并通过SWISS-MODEL预测了该酶的三维结构。     

VvmiR397a及其靶基因VvLACs在葡萄果实发育中的作用分析

以‘魏可’葡萄（Vitis vinifera‘Wink’）为试材,克隆了葡萄VvmiR397a前体基因（594 bp）,其可折叠成典型的茎环结构;同时鉴定了其成熟体序列（21 bp）,并为其预测到5条靶基因VvLAC4、VvLAC7、VvLAC11、VvLAC14和VvLAC17,它们属于木质素合成的关键酶漆酶家族（Laccase,LACs）。靶基因的domains、motif序列分析及三级结构预测显示,漆酶蛋白序列均具有3个相同的Cuoxidase结构域,其motif元件类型及排列顺序、三级结构均相似,表明漆酶结构较为保守。推测其功能比较保守,74个漆酶基因的进化分析显示葡萄漆酶基因与杨树漆酶基因亲缘关系近于拟南芥,葡萄漆酶基因在木本植物中的保守性高于草本植物。VvmiR397a及VvLAC4、VvLAC11、VvLAC14和VvLAC17的启动子均具有赤霉素响应顺式作用元件（TATC-box、GARE、P-box）,表明它们可能响应GA参与葡萄生长发育的调控。荧光定量PCR表达分析显示,VvmiR397a能被GA诱导显著上调,且在幼果、花和成熟叶中具有高的表达,其他组织中表达相对较低,尤其在幼果中表达量最高,硬核期表达量最低;而其靶基因VvLACs表现出相反的表达模式,在硬核期有最高表达,而该期是葡萄果核木质素合成量最大的时期,表明VvmiR397a可能通过负调控VvLACs参与葡萄果核发育的调控。利用RLM-RACE和PPM-RACE验证了VvmiR397a对VvLACs的裂解作用,且在幼果中裂解作用最强,而在硬核期果实中裂解作用最弱,与VvmiR397a的表达趋势相似。     

白菜多聚半乳糖醛酸酶基因B cM F6的克隆、序列分析及其表达

 从白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino) 核隐性不育两用系‘Bajh97201A /B’可育株中分离得到的一个cDNA-AFLP差异片段入手, 利用RACE技术成功克隆了一个花粉特异的多聚半乳糖醛酸酶( PG) 基因BcMF6的DNA和cDNA全长序列, 并对其序列进行了分析。结果表明, 该基因包含4个外显子和3个内含子, 最大开放阅读框为1 194 bp, 编码397个氨基酸序列, 对推导的氨基酸序列进行分析, 1到22个氨基酸是1信号肽序列, 其后有4个平行β螺旋重复( PbH1) 结构, 该序列包含3个N -糖基化位点, 4个蛋白激酶c磷酸化位点, 5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点, 10个N - 豆蔻酰化位点, 1个PG活性位点(²²⁷RVTCGPGHGIS1 IGS²⁴⁰ ) 等。将B cM F6基因氨基酸序列与数据库中的其他PGs基因进行同源序列比对, 构建系统进化树, 发现该基因具有所有PGs基因特有的4个保守结构域, 并且与花粉中特异表达的PG基因聚为一类, 表明该基因是与花粉发育相关的多聚半乳糖醛酸酶基因。RT-PCR对其表达的研究表明, 该基因在可育株(野生型) 的中大蕾、开放花和短角果中特异表达, 进一步表明该多聚半乳糖醛酸酶基因与白菜的花粉发育相关。     

不同苹果品种抗苹果绵蚜的漆酶基因表达模式及其原核表达载体筛选

【目的】明确不同苹果品种漆酶基因在抗苹果绵蚜过程中的差异表达模式，探索原核表达苹果漆酶蛋白的方法与条件。【方法】基于转录组测序分析抗蚜品种新红星(Starkrimson)、小国光(Ralls Genet)与感蚜品种红富士(Red Fuji)3个苹果品种被苹果绵蚜为害0 h、12 h、5 d后漆酶基因的表达模式，筛选抗蚜候选漆酶基因；选择pET-28a(+)、pET-32a(+)、pGEX-TEV、pHAT2 4种载体，对4个漆酶基因MdLac23、MdLac6、MdLac7、MdLac2进行原核表达，对表达产物进行Western-Blot验证，镍柱亲和层析纯化，以ABTS为底物分析其酶活性。【结果】与对照相比，不同苹果品种被害12 h、5 d后，苹果枝条中漆酶差异表达基因数量为27个。不同苹果品种的漆酶基因表达模式存在差异，抗蚜品种新红星及小国光漆酶差异表达基因上调表达居多，感蚜品种红富士下调表达居多，新红星12个基因上调表达，无下调表达基因；小国光9个基因上调表达，3个基因下调表达；红富士10个基因下调表达，4个基因上调表达。其中新红星特有的上调表达基因数量为6个，小国光特有的上调表...     

西瓜嗜酸菌tatB基因生物信息学分析

为了解西瓜嗜酸菌（Acidoworax citrulli）双精氨酸转运系统（Twin—arginine translocation system,Tat）关键基因tatB的生物信息学信息,利用相关软件对西瓜嗜酸菌和其他7种革兰氏阴性菌的TatB蛋白进行理化性质分析,氨基酸序列分析以及遗传距离分析;同时对西瓜嗜酸菌TatB蛋白的疏水性、跨膜结构域以及三级结构模型进行了预测。结果表明,西瓜嗜酸菌TatB的理化性质和洋葱布克氏菌（Burkholderia cenocepacia）更加接近,水稻自叶枯病菌TatB理化性质与其他6种细菌的相差较远：西瓜嗜酸菌TatB蛋白遗传关系与水稻自叶枯病菌（Xanthomonasoryzae）的最远,与洋葱酸皮病菌以及茄科雷尔氏菌（Ralstoni0solanacearum）的较为接近;预测西瓜嗜酸菌TatB蛋白有3个区域的疏水性比较高．在氨基酸序列的2．18位以及100～106位有2个跨膜区域,其三级结构可能为“L”型。对西瓜嗜酸菌tatB基因进行基本生物信息学分析,丰富了其生物信息学资料,有助于对西瓜嗜酸菌的致病机制进行深入研究,为以后选育抗病品种以及研发特异性的新药提供依据。     

灰树花己糖转运蛋白的生物信息学分析

以灰树花转录组数据为参考,筛选到己糖转运蛋白（GfHXT2）的c DNA序列,利用生物信息学方法对GfHXT2蛋白的理化性质、亲/疏水性、信号肽、亚细胞定位分析、跨膜螺旋结构、保守结构域、二级结构、三级结构、蛋白修饰位点和蛋白交互网络等方面进行预测和分析。结果表明：GfHXT2基因cDNA总长1 871 bp,CDS共编码380个氨基酸。综合分析GfHXT2基因蛋白质亲水和疏水的得分和理化性质分析结果,判定其为较稳定的亲水蛋白,不含信号肽,亚细胞定位分析结果表明其在内质网的概率为55.6%,跨膜螺旋结构数量为10个。GfHXT2蛋白的二级结构存在4种状态,分别为α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角。存在4个N端糖基化位点、3个O端糖基化位点。GfHXT2蛋白与13个蛋白质互作,即共同参与某一功能。     

农药克百威单链抗体基因构建及蛋白结构模拟

构建小分子农药克百威(CBF)单链抗体(scFv)基因cbf,进行蛋白质二级、三级预测并对其理化特性进行分析。采用重叠延伸PCR方法,以能特异性分泌抗CBF单克隆抗体的杂交瘤细胞株5D3为原料,构建抗CBFscFv基因cbf,进行测序,采用生物信息软件对氨基酸序列推导并进行结构预测,同时对理化性质进行分析。结果得出,抗CBFscFv基因cbl全长750bp,对应228个氨基酸,单链抗体分子量约为26315.1,等电点预测值5.66,为酸性蛋白质;二级结构显示抗克伦特罗单链抗体含α螺旋18处,β折叠108处,β转角24处,随机卷曲93处。cbf三级结构建模显示VL和VH符合scFv的结构特点,可观察到6个环区形成疏水的"口袋",具有抗原结合位点的空间构象。从而构建了一个抗CBFscFv基因cbf,应用信息学技术所获得的预测和分析结果为抗克伦特罗单链抗体的进一步表达、纯化和活性研究提供了大量的信息。     

苹果LysM类受体激酶基因家族鉴定与表达分析

以LysM(PF01476)和Pkinase(PF00069)保守域全蛋白序列为种子序列,在全基因组范围比对分析了苹果(Malus×domestica Borkh.)LysM-RLK家族的成员,对其家族成员的理化性质、进化关系、染色体分布、基因结构等进行了分析;基于已公布的转录组学数据,分析了LysM-RLK基因在苹果组织、发育过程和生物胁迫中的表达情况。通过分析,共获得12个苹果LysM-RLK基因,其氨基酸序列大小介于553~1 053,分子量介于62.65~119.04 kD,等电点介于5.11~7.45,主要位于质膜;根据进化分析将其分为3个亚组,亚组内各成员的外显子—内含子结构呈现较为相似的特征。基因表达数据显示,苹果的4个LysM-RLK基因表达存在较大的组织特异性,7个基因在苹果腐烂病和再植病发病过程中为差异表达。     

番茄超氧化物歧化酶的生物信息学分析

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶。以在NCBI数据库中注册的7种番茄SOD蛋白质为分析对象,利用生物信息学方法,分析了SOD蛋白质的理化性质、信号肽、糖基化位点、磷酸化修饰、一级和二级结构以及系统进化特点。结果表明:7种蛋白质间的理化性质存在较大差异;氨基酸序列中不含信号肽,均不是分泌蛋白;不同类型的番茄SOD中所含糖基化以及潜在磷酸化位点数目不同;它们的氨基酸序列同源性较低,二级结构也存在较大差异;系统进化树可作为番茄SOD家族蛋白遗传分化研究的重要依据。该研究为深入开展SOD的酶学特征及植物抗氧化的分子机制研究提供重要的理论依据。     

甘蓝型油菜紫色酸性磷酸酶基因类似物的生物信息学分析

利用生物信息网络数据库,对甘蓝型油菜紫色酸性磷酸酶基因(PAP)类似物编码的蛋白进行生物信息学分析,以预测该蛋白的理化性质、分子结构与生物学功能。结果表明:该基因编码的蛋白含481个氨基酸,其蛋白的分子式为C2520H3714N666O719S19,分子量为55.45kDa,等电点为6.35,为亲水性分泌型蛋白,并且不稳定;存在3个跨膜螺旋区域及3个卷曲螺旋结构,含有1个信号肽、39个潜在磷酸化位点和3个N-糖基化修饰,存在6种类型特定的功能位点,主要定位于高尔基体;氨基酸序列同源性分析表明,该基因编码的蛋白与甘蓝型油菜PAP12家族具有较近的亲缘关系,直系同源于甘蓝型油菜PAP12-5;二级结构主要为无规则卷曲、延伸链和α?螺旋,具有较为明显的10个螺旋和26个折叠;具有PAP的保守结构域,属于金属磷酸二酯酶超家族成员;根据保守结构域及功能位点分析发现该基因属于紫色酸性磷酸酶类,可能属于甘蓝型油菜PAP基因家族成员,预测其编码产物在植物磷高效利用与吸收中发挥重要的生理功能。生物信息学分析及结合蛋白的结构与功能预测分析可为深入研究甘蓝型油菜PAP提供理论指导。     

甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好及功能预测分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基因片段,通过RACE技术克隆基因全长序列;该基因ORF长度2718 bp,编码905个氨基酸,分子量大小为102kD（ExPaSy的分子量分析）,等电点为6.12,含有147bp的5＇UTR和382 bp的3＇UTR,Genbank上的注册号为EU163265,甜菜硝酸还原酶基因编码多肽含有3个氧化还原功能区：钼辅因子功能区（eukary NR Moco;93-478）,Fe-血红素结合区（Cyt-b5;535-608）,FAD结合区（FAD binding 6;653-760）。利用网上的公共数据库和相关软件对该基因氨基酸偏好和编码蛋白的理化性质进行了分析,并对其功能进行了预测。上述研究结果为下一步基因的表达与调控研究奠定了基础。     

管状花目中多酚氧化酶的序列分析与功能预测

以管状花目(Tubiflorae)中5个物种7个多酚氧化酶基因(PPO)序列为研究对象,采用序列对比分析和功能预测方法,研究了这些基因序列的碱基、酶蛋白氨基酸序列数量与比例,以及氨基酸序列中蛋白激酶C磷酸化、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化、N-糖基化、N-豆蔻酰化、酰胺化、cAMP及cGMP蛋白激酶磷酰化6个功能位点结构域特征,以期揭示PPO酶调控的功能位点。结果表明:管状花目中丹参毛状根PPO基因含有G+C碱基最多,氨基酸中丙氨酸和亮氨酸含量也最高(16.9%),并含有最多的酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点(11个)。丹参毛状根PPO酶不具备信号肽结构,有1个卷曲螺旋,是无跨膜结构的亲水性蛋白。该试验为研究PPO酶调控酚酸类物质次生代谢的分子机制,特别是蛋白与蛋白、蛋白与基因之间的互作奠定了基础。     

西瓜CIPK家族基因的鉴定与特征分析

CIPK(Calcineurin B-like-interacting protein kinase)是一类植物中十分重要的蛋白激酶,主要参与植物的生长发育和抗逆过程。为了揭示CIPK基因家族在西瓜生长发育与抗逆防御机制中的重要作用,该研究基于西瓜基因组数据库,利用生物信息学手段,鉴定并分析了西瓜CIPK家族基因的基因结构、染色体定位、系统发育和氨基酸理化性质等特征。结果表明:西瓜中有19个CIPK家族成员,分别分布于1~6、8,10号的染色体上,编码氨基酸序列长度为330~565bp,其中18个ClCIPK氨基酸序列含NAF功能域,仅有1个CIPK(ClCIPK9)基因不含有此结构;CIPK基因家族成员的基因结构大致分为内含子富集和内含子缺失2类;进化树聚类分析结果将所有的西瓜及拟南芥CIPK蛋白分为5类,在每一类中都包含西瓜和拟南芥的CIPK家族成员,说明它们具有很高的同源性,并推测它们可能参与了西瓜的多种生物学过程。该研究结果以期为ClCIPK基因在西瓜育种中的功能研究与应用提供重要的理论基础。     

荔枝ANS基因的克隆及其序列分析

以3个不同发育时期的‘糯米糍’荔枝果皮和幼嫩叶片为试材,对其ANS基因进行了克隆及分析。结果表明:花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)是花色素苷生化合成途径中的一个关键酶。利用同源克隆方法从荔枝果皮中克隆得到了1个ANS基因,该基因开放阅读框的长度为1 074bp,编码357个氨基酸。以基因组为模板,扩增得到了1 279bp的核苷酸序列与cDNA序列比对发现,基因组序列中还有1个内含子,位置在504～708bp之间。通过系统发育分析发现,该基因编码的蛋白与葡萄、可可豆、柑橘等聚为一类。     

青天葵1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因片段的鉴定和分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类MEP生物合成途径的第一个限速关键酶,提高其编码基因的表达可提高植物萜类化合物的含量。该研究在青天葵全转录组测序数据中获取青天葵DXS基因片段序列,利用生物信息学方法对其系统发育进化、保守功能域、理化性质、亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽等进行分析和预测,并采用RPKM法分析其在青天葵叶片和球茎的表达量,为后期利用DXS基因调控青天葵萜类成分的生物合成提供理论依据。结果表明:NfDXS基因片段序列长度为2 154bp,编码含有718个氨基酸、分子量约为77.45kDa的亲水性蛋白,与其它DXS同源性可达80%。NfDXS具有1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶功能域,没有信号肽和跨膜结构域,二级结构表现为混合型结构蛋白质。NfDXS基因在青天葵中的表达趋势为:叶片球茎。     

植物查尔酮异构酶的生物信息学分析

采用生物信息学方法和工具对GenBank中的洋葱、豌豆、番茄和茶等植物的黄酮类化合物合成关键酶查尔酮异构酶(CHI)的核酸和氨基酸序列进行了比对、分析和建模,进而对其分子结构、理化性质、亚细胞定位、蛋白转运肽、跨膜结构域、疏水性、分子系统进化、蛋白质二级和三级结构等重要参数进行了预测和推理.结果表明:该类酶基因的全长包括5'、3'非翻译区和一个开放阅读框,无蛋白转运肽,且定位于细胞质基质,是一个疏水性蛋白,二级结构均以随机卷曲和α-螺旋为主要构件,洋葱和豌豆的CHI三维建模成功.     

木耳漆酶高产菌株筛选及其发酵条件的研究

通过运用不同检测方法对木耳属中的三个种的 2 7个菌株的产过氧化物酶、漆酶能力的检测 ,筛选得到一漆酶高产菌株毛木耳 (Auriculariapolytricha)AP4。并且对AP4的产漆酶的发酵条件进行了初步研究。摇瓶实验产漆酶的最佳培养基的成分为 :碳源羧甲基纤维素(CMC) 5g/L ,氮源NH4NO3 L -天冬酰胺 (L -As paragine) 2 4mmol/L ,培养基的初始pH4 0 ,培养温度2 5℃。     

香蕉α-淀粉酶基因家族的系统进化分析

α-淀粉酶(Amy)是一类关键的淀粉水解酶,在香蕉果实成熟淀粉降解转化为可溶性糖的过程中发挥着重要作用。本研究基于香蕉基因组数据,通过生物信息学的方法对香蕉α-淀粉酶基因的基本理化性质、二级结构预测、亚细胞定位、内含子和外显子结构和保守结构域进行初步的预测与分析,并构建系统发育树。结果表明,编码香蕉α-淀粉酶的基因有12个,根据在染色体的位置命名为MaAmy1~12,MaAmy基因家族编码的氨基酸的范围在79~914个,编码的蛋白相对分子量介于8.8~103.2kD之间,12个MaAmy蛋白中有8个偏酸性,3个偏碱性。不稳定指数分析发现,8个MaAmy蛋白为稳定蛋白;疏水性分析表明,所有的MaAmy蛋白为亲水性蛋白;香蕉MaAmy家族最多的含有13个内含子;进化分析表明,MaAmy家族分4个亚家族。     

10种蔷薇科果树AAT基因家族鉴定、特性与表达分析

【目的】利用生物信息学对10种蔷薇科果树的AAT基因家族进行分析,为果实香气调控的候选基因鉴定提供前期基础。【方法】基于10种蔷薇科果树的全基因组测序结果,应用保守结构域鉴定不同果树的AAT基因家族,分析其理化性质、保守域结构、亚组分类、进化关系、内含子与外显子结构、染色体定位等信息。【结果】10种蔷薇科果树中共鉴定出46个AAT基因序列,分别为中国白梨4个、梅4个、桃8个、苹果7个、西洋梨4个、杜梨6个、甜樱桃2个、森林草莓1个、凤梨草莓7个以及黑树莓3个,各物种AAT基因随机分布在染色体上。通过聚类分析,将这46条基因序列分为4个区组;亚细胞定位与理化性质分析显示,AAT蛋白主要定位于细胞质上,整体在弱酸性至弱碱性的范围内,为亲水性蛋白,同时大部分蛋白呈现不稳定的状态。通过共线性与表达分析,发现蔷薇科果树AAT基因家族在其进化过程中主要受纯化选择作用的影响。【结论】在10种蔷薇科果树中,共鉴定出46个AAT基因家族序列,最少的为森林草莓(1个),最多的为桃(8个)。AAT基因家族的各序列结构相对保守,受纯化作用的影响明显。     

香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基克隆与生物信息学分析

通过PCR技术成功克隆1个香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因的全长序列,并登录GeneBank,登陆号为FJ973633。利用生物信息学方法,分析香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基基因序列,对其推导的氨基酸的理化性质、亲水性/疏水性、跨膜结构、导肽、二级结构进行预测,并对香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基的氨基酸做进化发育分析,为进一步了解香蕉1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶小亚基在香蕉光合吸收中的作用奠定基础。