亚麻生氰糖苷合成关键酶CYP79基因家族的鉴定及表达分析

CYP79蛋白是生氰糖苷合成关键酶,但关于亚麻CYP79基因的研究鲜有报道。本研究对包括亚麻在内的9种作物的CYP79基因家族进行了鉴定,并分析了亚麻CYP79基因的序列特征、复制事件、共线性关系、系统进化、顺式作用元件及表达模式。结果表明,在亚麻、白亚麻、毛果杨、木薯、芝麻、高粱、大豆、葡萄及水稻中分别鉴定到9、9、3、2、5、7、6、16和4个CYP79家族成员;系统进化分析显示, CYP79基因的进化具有物种特异性; LuCYP79不均匀分布在4条染色体上,具有1～3个外显子,其启动子区含大量激素与逆境响应相关元件;共克隆到8个亚麻CYP79基因的全长DNA序列及5个成员的全长cDNA序列;LuCYP79蛋白序列长度为282～565aa,等电点为5.84～9.14,分子量为31.56～62.86kD,均为亲水性蛋白,定位于内质网;共有5对基因发生复制事件,占全部基因的77.8%,全部经历了强烈的纯化选择,其中LuCYP79-1和LuCYP79-9在拟南芥和木薯中均具有同源基因。表达分析表明, LuCYP79家族成员具有组织特异性,且各成员在不同遗传背景下表达模式不同,其中LuCY...     

木薯MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子克隆及表达模式分析

MeCYP79D1和MeCYP79D2基因是调控木薯生氰糖苷合成的关键基因,研究其表达特性对低氰木薯改良具有重要意义。为了探究MeCYP79D1和MeCYP79D2基因在SC8木薯品种中的表达模式,本研究克隆获得了SC8木薯品种的MeCYP79D1和MeCYP79D2基因启动子,发现它们的启动子上具有ABA、SA、GA、Me JA及生长素等激素响应元件,同时具有低温、干旱、伤害胁迫相关元件。采用ABA、SA、GA3、MeJA、低温处理,证明MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达受激素和低温调控。MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在须根中表达,其次为嫩叶;在块根发育过程中,MeCYP79D1和MeCYP79D2基因主要在块根形成期和膨大前期表达。此研究结果为解析MeCYP79D1和MeCYP79D2基因表达调控机理提供了新的线索。     

一个与氰苷生物合成相关的植物CYP基因的克隆与表达分析

氰苷是由植物细胞色素P450单加氧酶(CYP)催化氨基酸生成的次生代谢产物,与植物的防御和抗逆境胁迫相关。为了获得蒜头果中与氰苷生物合成有关的CYP基因,本研究通过分析蒜头果转录组数据,从中分离并克隆得到1条细胞色素P450基因(命名为MoCYP79),并对其进行生物信息学分析及检测该基因在果实不同发育时期的具体表达情况。结果显示,MoCYP79基因的cDNA全长1632 bp,编码543个氨基酸;MoCYP79蛋白含有CYP家族的识别结构域血红素结合域(FSTGRRGC),且与巨桉(XP_010027351.1)、木薯(AAF27290.1,AAF27289.1)等植物CYP79蛋白聚在一支;MoCYP79基因在蒜头果花谢后的果实中表达量呈下降趋势,除发育3个月的果实外,该基因在其余的果实中的表达量均显著高于叶片,从大到小依次为花谢后的果实1个月>2个月>4个月3个月。本实验对研究蒜头果的对病虫害的防御、逆境胁迫的抵御及蒜头果中有效次生代谢产物的发掘具有重要的意义。     

绞股蓝皂苷生物合成后修饰酶基因的cDNA克隆和组织表达特征

从绞股蓝转录组挖掘可能与绞股蓝皂苷生物合成相关修饰酶基因细胞色素P450(cytochrome P450,CYP)及UDP-糖基转移酶(UDP-dependent glycosyltransferase,UGT)基因的cDNA进行克隆并开展了以下研究。根据课题组前期绞股蓝转录组数据,筛选CYP及UGT Unigenes,利用RT-PCR克隆ORF全长,并结合生物信息学对其编码蛋白进行功能分析,最后通过荧光定量PCR验证其在根、茎、叶的差异性表达。结果克隆得到两个ORF序列,分别命名为CYP94A1和UGT91A1;CYP94A1序列包含1509 bp的开放阅读框架,编码一条含503个氨基酸残基的肽链,具有CYP保守结构域;UGT91A1序列包含1383 bp的开放阅读框架,编码一条含461个氨基酸残基的肽链,具有UGT保守结构域。这两个基因的转录表达均具有组织特异性,在叶或茎中的表达均高于根。CYP94A1和UGT91A1的克隆、转录表达及生物信息学分析为进一步挖掘绞股蓝中CYPs、UGTs及功能验证提供了帮助,增加对CYP和UGT两个超基因家族的认识。     

木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITVb基因克隆及其表达载体构建

几丁质酶在生物逆境环境和非生物逆境环境中发挥着重要作用.为研究木薯几丁质酶在响应低温胁迫下的分子作用机制,利用RT-PCR技术,从木薯耐低温品种SC124中克隆到CHITVb基因,利用平末端连接技术构建pEASY-MeCHITVb克隆载体,用于测序确定目标基因序列,并对其序列进行分析,构建植物表达载体.结果 表明,成功克隆木薯CHITVb基因,命名为MeCHITVb.通过生物信息学分析,该基因全长1050 bp,编码349个氨基酸,理论相对分子量为38.08 kD,理论等电点为4.53,是一种稳定蛋白.经序列比对和系统进化树分析表明,MeCHITVb基因与烟草、拟南芥V型几丁质酶基因亲缘关系最近.用pEASY-MeCHITVb与植物表达载体pISV2678构建重组子pISV-MeCHITVb,利用"Golden Gate"克隆方法构建基因编辑载体CRISPR/Cas9-MeCHITVb.将植物过表达的pISV-MeCHITVb和CRISPR/Cas9-MeCHITVb载体成功转化为根状杆菌LBA4404.本研究为后续MeCHITVb基因功能研究、木薯抗寒、抗病品种的选育及木薯北移栽培提供理论依据.     

大豆高丝氨酸代谢途径相关酶基因的电子克隆与定位分析

本研究借助已经构建的本地化EST数据库,利用不同物种对应基因序列进行比对、拼接,成功从大豆中克隆了4个高丝氨酸代谢途径相关酶基因,同时应用已构建的大豆整合图谱,克隆了大豆高丝氨酸代谢途径中7个相关酶基因,并进行了定位分析。通过对氨基酸序列进行比对分析,表明大豆高丝氨酸代谢途径相关酶基因在植物中具有较高的同源性,且序列同源性多大于60%,且与双子叶植物对应序列同源性较高,但与单子叶植物对应基因同源性稍低。从基因定位分析的结果可以看出,7个大豆高丝氨酸代谢途径相关酶基因被定位在D1a、N、B2、G、J和D2六个连锁群上,并同时获得了对应连锁群区间两侧的标记。基因结构分析表明,7个基因的g DNA片段长度介于1 083~5 818 bp之间;c DNA片段长度介于1 083~3 166 bp之间;内含子数目介于0~11个之间,外显子数目介于1~12个之间。本研究为其他氨基酸合成相关酶基因的克隆提供了参考依据,并为基因功能研究以及分子辅助育种打下良好的基础。     

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因（GhCYP51G1）的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1 (GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2 kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6 d胚珠、开花后0 d和2 d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8 d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。     

马蔺VP基因的克隆与植物表达载体构建

以马蔺幼根总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到马蔺H+-PPase全长序列并克隆到p MD19-T载体,命名为Il VP。序列分析表明该基因的开放阅读框为2 316 bp,编码771个氨基酸,推测等电点为5.16,分子量为80.7 k D,所得到的序列与Gen Bank中注册的高等植物液泡膜H+-PPase的核苷酸序列相比,其同源性均达到70%以上,其氨基酸序列的同源性则达到79%以上。用SmaⅠ和SacⅠ分别对目的基因质粒和植物表达载体p BI121进行双酶切,在DNA连接酶的作用下进行定向连接,构建成植物重组质粒p BI121-35S-Il VP-Nos,再转入根癌农杆菌EHA105中,为该基因在烟草等植物中遗传转化和基因功能研究奠定基础。     

利用改良RACE方法克隆木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的研究

首次从木薯中分离克隆出AGPase 小亚基的基因5’端cDNA序列,最终为进一步成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因的cDNA全长序列提供依据。本研究以木薯作为试验材料,设计锚定引物,并根据木薯AGPase 小亚基基因已知序列设计PCR特异引物,利用逆转录引物AUP1 反转录总RNA,然后分离纯化反转录产物,通过对三大酶促反应（逆转录反应,TdT 加尾,巢式及降落PCR技术）的具体改良,并将其与传统方法进行比较。利用改良后方法,首次成功获得木薯淀粉合成关键酶AGPase 小亚基基因5’端cDNA序列。同时,本研究通过对RACE技术的改良与传统方法相比,在操作上更加简单、快速;在序列获得上更加高效;在试验成本上更加低廉。本研究可以高效且快速的成功获得木薯淀粉关键酶AGPase小亚基基因5’端序列,具有一定的实用性及简便性。     

木薯SR家族基因的克隆和亚细胞定位

木薯(Manihot esculenta Crantz)是热带地区重要的粮食和能源植物,关于木薯的分子生物学研究对栽培品种的遗传改良和性状优化具有积极的理论指导意义。本研究以木薯基因组数据库为基础,Gateway誖技术为主要手段,克隆了木薯剪接因子SR蛋白(MeSRs)家族18个成员,进行生物信息学分析和亚细胞定位。通过氨基酸序列同源性分析将其分为6类;蛋白理化性质分析表明,由于富含带正电荷的Arg残基,SR蛋白均为亲水的碱性蛋白。通过在烟草叶表皮细胞中表达GFP融合蛋白,发现全部18个基因都具有位于细胞核中的荧光信号,表明木薯SR蛋白是核定位蛋白。本研究为后续深入探究木薯剪接因子SR蛋白家族基因功能及选择性剪接的调节机制提供科学帮助。     

玉米螟细胞色素P450家族CYP6AE25的克隆及序列分析

摘要：昆虫细胞色素P450是一类在生物代谢中起重要作用的基因家族,承担着许多重要的生理功能,包括对植物次生物质代谢和杀虫剂的解毒等。本研究以玉米螟5龄幼虫总RNA为模板,根据不同昆虫P450基因家族保守氨基酸序列,设计并合成简并引物,利用RT-PCR扩增出了玉米螟细胞色素P450基因的中间片段,通过RACE技术获得玉米螟P450基因家族一员全长序列,将其克隆到pMD19-T载体进行序列测定。测序获得了编码523个氨基酸残基的2315 bp的全长cDNA,命名为OfP450(GenBank登录号：EU807990)。国际P450命名委员会将其定为CYP6AE25。本文还从生物信息学角度对CYP6AE25进行分析,分别从蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、跨膜结构域、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测。进一步研究其高级结构与功能的关系提供理论依据。CYP6AE25蛋白与其它P450分子进化树分析结果显示,与昆虫CYP6家族同源性较高,与CYP其他家族的遗传距离较远,同源性较低。     

Cassava starch biosynthesis: new avenues for modifying starch quantity and quality

The genes coding for the main enzymes involved in cassava starch biosynthesis have been cloned and characterised. Molecular analysis of these genes revealed high amino acid sequence homology with other cloned genes from starch forming plant species. Use of these genes to modify the pathway of starch biosynthesis in cassava has become possible with the advent of a reproducible transformation and regeneration protocol for cassava. This would enable the development of new cassava cultivars able to produce starches with different physico-chemical properties and uses. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

紫苏苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆及序列分析

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase,PAL）是迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸支路的关键酶,它催化苯丙氨酸生成肉桂酸,完成该支路第一步反应。本实验利用同源克隆方法成功克隆了紫苏PAL基因cDNA片段,命名为PerPAL-1（GenBank登录号：HQ388347.1）,该片段长399 bp,编码133个氨基酸。通过氨基酸序列比对分析,发现其氨基酸序列与丹参和藿香PAL该片段的同源性分别高达96%和95%。PAL系统进化树表明PerPAL-1与唇形科植物的PAL亲缘关系最近。PerPAL-1基因在叶中表达最强,根中次之,而在茎中表达最弱。     

高效液相色谱-蒸发光检测法测定木薯生氰糖苷的含量

为研究所收集木薯品种叶片中生氰糖苷含量的高低,笔者将所有品种茎杆按木薯正常种植方式扦插于试验地中,在收获季节前采集顶端倒数第2叶,通过HPLC测定各品种叶片中生氰糖苷的含量。结果表明,与国外所用木薯品种‘Mcol22’相比,在笔者所测试的木薯品种中,包括热区大面积推广的‘华南5号’(SC5)和‘华南8号’(SC8)中,大部分生氰糖苷含量都不高,其中‘Q10’生氰糖苷最低,每克鲜重只有11.3μmol,大约是最高含量‘Ecu81’的1/4。研究结果为筛选低生氰糖苷含量的木薯资源提供了一个参考。     

甘蓝型油菜烷羟化酶基因MAH1的克隆与表达分析

在植物蜡质合成途径中,中链烷烃羟化酶(mid-chain alkane hydroxylase,MAH)催化烷烃羟基化形成二级醇,进一步氧化为酮。本研究以拟南芥P450依赖性酶CYP96A15/MAH1基因为探针,采用电子克隆与RT-PCR技术,获得2个甘蓝型油菜MAH1的全长编码区序列,分别命名为BnMAH1-1和BnMAH1-2(Gen Bank登录号分别为KT795344和KT795345)。二者ORF长度均为1491 bp,无内含子,核苷酸与氨基酸序列分别有92.4%与90.9%的一致性。根据编码区预测的BnMAH1-1和BnMAH1-2前体蛋白均为包含496个氨基酸残基的多肽链,具有典型的P450蛋白家族保守结构P415x R417x、K螺旋(E359xx R362)、C末端的血红素结合域(F436xx Gx Rx Cx G445)以及氧结合带保守区域(A/G)G309x(D/E)T312(T/S)。NCBI Blast N、氨基酸序列多重比对与系统学分析表明,两者与拟南芥MAH1/CYP96A15同源性最高。实时荧光定量PCR表明,BnMAH1-1与BnMAH1-2主要在甘蓝型油菜茎、叶、花、及角果中表达,其中在叶片中的表达量最高,在根系中的表达量很低,这与角质层蜡质主要沉积在植株地上部分相一致。BnMAH1-1和BnMAH1-2在无蜡粉材料茎、叶片中几乎不表达,表明蜡质的减少与MAH1的转录下调有关。BnMAH1-1与BnMAH1-2受SA、Me JA、ACC、ABA、Na Cl及干旱胁迫诱导表达,其中BnMAH1-1可能在水分胁迫响应中起主要作用。     

飞机草类黄酮3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达

利用RT-PCR和RACE技术从飞机草中克隆得到1628 bp的类黄酮3’-羟化酶c DNA的全长序列,命名为Co F3’H,Gen Bank登录号为HQ268505.1。Co F3’H基因的编码区长度为1524 bp,编码507个氨基酸。氨基酸序列含P450蛋白结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G),利用DNAMAN软件比对显示,Co F3’H与其他植物的F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将Co F3’H基因导入烟草,T2代的转Co F3’H基因烟草植株的黄酮含量显著高于野生型。说明Co F3’H在黄酮的生物合成中起重要作用,为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。     

小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

瓜叶菊F3＇5＇H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表达

蓝色花的形成主要由于是花瓣中3＇,5＇-羟羟基花青素（飞燕草色素及其衍生物）的相对含量较高,类黄酮-3＇,5＇-羟基化酶（F3＇5H）是合成这类色素的关键酶.不同物种F3＇5＇H同源基因的分离与特征解析能够为蓝色花的分子育种工作提供更多的理论依据.瓜叶菊花色多变,舌状花有白色、红色和蓝紫色等.根据已知F3＇5＇H保守的氨基酸序列设计了3条简并引物,通过RT-PCR从蓝色的瓜叶菊舌状花中扩增出了保守序列;利用RACE方法得到了两端序列.设计全长引物RT-PCR分离出了瓜叶菊F3＇5＇H同源基因（PCFH）.cDNA全长1 660bp,编码505个氨基酸.序列分析表明PCFH编码的氨基酸序列中包含有已确定的保守基序,包括血红素结合区、Ⅰ螺旋区和膜插入点的信号序列等.与其它物种的F3＇5＇H基因的序列相似性也较高.与翠菊、拟南芥和矮牵牛的序列相似系数分别为76%、59%和50%.序列相似性表明PCFH基因与茄子、矮牵牛和草原龙胆等同属于CYP75亚家族.利用pET28a载体PCFH在大肠杆菌BL21中实现了表达,IPTG诱导的差异蛋白大约为57kD,PCFH编码的多肽分子量相近,这将为进一步研究PCFH的酶学特性奠定了基础.