粗山羊草（Ae.tauschii）幼苗和根全长cDNA文库构建及其EST注释与比较分析

 【目的】构建小麦D基因组供体粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，探讨利用生物信息学方法分析发掘组织特异性表达基因的可行性。【方法】本研究利用Cap-trapper方法构建全长cDNA文库，利用高通量测序技术获得大批高质量EST序列，在基于Linux系统的本地化生物信息学分析平台上对上述EST进行了电子注释分析。【结果】成功构建了粗山羊草根和叶的全长cDNA文库，测序获得根EST序列6 973条和叶EST 6 616条。利用本地化数据分析平台对其进行功能注释。利用GO-Diff软件，发现了两个文库间表达基因的功能差异，找到组织间表达差异显著的基因和组织内特异性表达的基因。【结论】利用构建的全长cDNA测序获得大量EST序列，通过生物信息学方法挖掘差异表达或特异性表达基因的方法是可行的。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

小麦叶锈菌与TcLr19非亲和互作cDNA文库的EST分析

 【目的】建立小麦叶锈菌与小麦非亲和互作的基因表达数据库,为从分子水平阐明小麦抗叶锈病机制奠定基础。【方法】对叶锈菌诱导的TcLr19小麦叶片cDNA文库随机测序,利用BLASTx对所得序列进行功能注释,按照Bevan的植物基因功能分类标准进行分类。采用RT-PCR技术,以Actin为参照,对2条信号转导相关基因和3条抗病与防御相关基因进行表达分析。【结果】随机对cDNA文库中756个阳性克隆测序,获得649条高质量EST。对EST序列聚类拼接获得472条非重复序列(Unisequence)。功能分类结果表明,25.2%为未知功能蛋白,21.0%与能量代谢基因相关,17.8%与抗病防御基因及信号转导基因相关,其余EST分别与转录、转运、蛋白代谢等功能基因相关。RT-PCR分析结果表明同一基因在叶锈菌侵染后不同时间点的小麦叶片中表达量不一致,且各基因有不同的表达模式。【结论】推测钙转运ATP酶,谷胱甘肽-S-转移酶,蛋白激酶Pti1,NBS-LRR抗病蛋白和分子伴侣DnaJ等参与了小麦与叶锈菌的非亲和互作过程。该cDNA文库可用于了解小麦与叶锈菌非亲和互作过程中的功能基因,为建立研究病原菌基因及小麦抗病基因数据库奠定基础。     

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

 【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα 基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2 859 bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架（ORF,172～2 604 bp）,编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。     

苎麻UDPGDH基因的cDNA克隆及表达分析

【目的】分离苎麻尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDPGDH）基因。【方法】通过简并引物RT- PCR 结合 RACE 技术和半定量RT-PCR。【结果】成功克隆苎麻Boehmeria nivea (Linn.) Gaud.尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶（UDPGDH）基因cDNA序列,序列长1 837 bp,编码一480个氨基酸的蛋白质（GenBank No.EF178294）。半定量RT-PCR分析显示,UDPGDH在苎麻根、皮、茎和叶组织中均有表达,其表达量为茎＞皮＞叶＞根,相对表达量依次为0.7075,0.3051,0.2651,0.1490。【结论】苎麻UDPGDH与其它植物相应序列具有较高同源性,在苎麻茎中有较高的表达。     

中国野生毛葡萄白粉菌诱导响应VqAP基因的克隆及表达分析

【目的】克隆中国野生毛葡萄"商-24"天冬氨酸蛋白酶(AP)基因的cDNA序列,明确其在葡萄抗病防御机制中的作用。【方法】在前期获得的中国野生毛葡萄株系"商-24"AP基因(VqAP)EST序列的基础上,采用RT-PCR克隆AP基因的cDNA序列,对其序列及编码产物进行生物信息学分析,并通过实时定量PCR和半定量PCR,分析VqAP基因在白粉菌诱导不同时间(0,6,12,24,48,72,96和120h),不同激素(100μmol/L水杨酸,50μmol/L乙烯和0.5g/L茉莉酸甲酯)刺激及不同组织(嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须)中的表达情况。【结果】序列分析表明,VqAP基因序列长度为1 377bp,具有开放阅读框,编码458个氨基酸残基,相对分子质量为50.48ku,等电点为8.73。保守结构域分析表明,VqAP编码产物含有2个保守的具有催化活性的天冬氨酸残基,位于Asp-Thr/Ser-Gly(DT/SG)结构域,该基因编码的氨基酸序列属于植物天冬氨酸蛋白酶A1家族,为非典型的天冬氨酸蛋白酶。荧光定量PCR结果表明,接种白粉菌后6h,VqAP基因表达量为0h的6倍多,之后迅速下调;不同激素处理后,该基因也均诱导表达,这可能是由于VqAP基因参与了植物早期的抗病反应,以及由不同激素诱导的发病相关基因的调节作用。半定量PCR结果表明,在葡萄嫩叶、嫩茎、花、果皮、卷须等不同组织中VqAP基因的表达量不同,这可能与它参与了植物不同组织中功能蛋白的合成与降解有关。【结论】VqAP的表达响应病原菌侵染并受生物胁迫相关激素的调控,可能在葡萄防御病原菌侵染的机制中发挥重要作用。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS2,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号:GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号:GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+/H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

棉花盐胁迫途径中蛋白磷酸化同源基因(GhSOS2)2种剪接体的克隆及表达分析#br#

【目的】了解棉花在盐胁迫条件下相关基因的表达,并克隆与抗(耐)盐相关的重要基因。【方法】通过筛选棉花EST数据库,并对目标EST序列进行整合,对中棉所49在非盐胁迫和盐胁迫条件下进行处理并利用RT-PCR的方法克隆了质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径中的1个蛋白磷酸化同源基因,命名为GhSOS,并通过实时荧光定量PCR对其表达特征进行分析。【结果】序列分析表明,该基因成熟mRNA的剪接存在2种可选择性的剪接体,分别命名为GhSOS2a(GenBank登录号：GU188960)和GhSOS2b(GenBank登录号：GU188961),分别编码445和421个氨基酸残基。由于剪接方式的差异,导致GhSOS2a比GhSOS2b多出一个外显子(长度为72 bp)。实时荧光定量PCR分析表明,GhSOS2a在非盐胁迫和盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织均表达,但GhSOS2b仅在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,且表达量远高于GhSOS2a。【结论】在棉花盐胁迫过程中,GhSOS2存在2种可选择性剪接体,而且可能主要是GhSOS2b参与棉花的质膜Na+／H+逆向转运蛋白途径并发挥一定作用。     

葡萄VviSEP2基因的克隆及表达分析

【目的】克隆葡萄VviSEP2基因的完整开放阅读框(ORF)序列,明确其与胚珠败育型无核葡萄胚珠败育的关系。【方法】通过RT-PCR技术在‘无核白’葡萄中克隆葡萄VviSEP2基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析VviSEP2的表达模式。【结果】克隆得到一个无核葡萄胚珠发育相关基因,该基因cDNA序列长度为1 132bp,ORF为741bp,编码246个氨基酸。氨基酸多序列比对和进化树分析确认,该基因是E类MADS-box基因家族成员,命名为VviSEP2。表达分析结果表明,VviSEP2只在花蕾、花和胚珠中有表达,而在根、茎、叶中无表达,并且该基因在有核葡萄‘黑比诺’花与花蕾中的相对表达水平明显高于无核葡萄‘无核白’,同时VviSEP2基因在‘黑比诺’胚珠发育各时期的相对表达水平均高于‘无核白’,为后者的3~5倍。【结论】VviSEP2基因与无核葡萄的胚败育可能存在一定关系。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

猪体内与孤雌激活早期胚胎发育特定阶段差异表达基因筛选

 【目的】研究早期胚胎发育基因,筛选猪早期体内发育胚胎和体外孤雌激活胚胎的差异表达基因,探讨影响胚胎发育的分子基础。【方法】分别采用孤雌激活和手术（猪体内发育）的方法收集2细胞、4细胞、8-16细胞时期的胚胎,利用SPEDDRT-PCR挑选不同时期的差异表达产物,将所获得的产物按照片段大小分离纯化后通过反向Northern杂交去除假阳性条带。将阳性条带克隆入T载体中,经过PCR鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序。【结果】筛选了11个代表不同时期表达差异的cDNA片段,编号为DDD1-DDD11。经过与GenBank数据进行同源性分析,发现其中DDD3、DDD11没有同源序列信息,提交数据库获得GenBank登录号（EU597224、EU597228）,其余序列发现相似性较高的数据。【结论】对体内正常发育胚胎和孤雌激活胚胎进行对比、分析,发现体内4细胞期和体内8-16细胞期各有1个片段为新基因片段,为进一步分析发育相关基因及其功能奠定基础。     

葡萄全基因组DELLA蛋白基因家族鉴定及其应答外源赤霉素调控葡萄果实发育的特征

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鉴定葡萄基因组中的DELLA蛋白基因;以‘白罗莎里奥’葡萄品种为试材,采用PCR技术克隆3个DELLA蛋白基因的c DNA全长序列;通过启动子作用元件分析预测其潜在功能;利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、系统进化、理化特性、亚细胞定位及蛋白互作等进行分析;利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术分析DELLA蛋白的亚细胞定位情况;采用q RT-PCR方法检测葡萄DELLA蛋白基因应答GA在果皮、果肉、种子(或种子区)的时空表达特征。【结果】鉴定得到3个葡萄DELLA蛋白基因,克隆并验证其精确序列,分别命名为Vv GAI1(VIT_201s0011g05260)、Vv RGA(VIT_214s0006g00640)及Vv SLR1(VIT_211s0016g04630),其染色体定位、开放阅读框(ORF)大小、编码氨基酸数量分别为:Chr1、1 773 bp、590个;Chr14、1 710 bp、569个;Chr11、1 599 bp、532个。基因结构分析表明其DNA序列均无内含子,只有1个外显子,基因结构高度保守。进化分析显示Vv GAI1与Vv RGA亲缘关系较近,被聚类为一组,而Vv SLR1为另一组。3个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和胚乳发育过程。亚细胞定位结果显示3个DELLA蛋白均定位于细胞核。q RT-PCR结果显示除果皮中Vv SLR1在近成熟期具有表达高峰外,其余均在幼果期高表达,且外源GA处理均不同程度降低了3个DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和种子区的表达,尤以种子区下调水平最为显著。蛋白互作分析表明3个DELLA蛋白均为葡萄GA信号传导的核心作用元件,均可能与GIDI1和SLY1互作参与葡萄GA信号传导。【结论】葡萄基因组中含有3个DELLA蛋白基因家族成员;不同物种间DELLA蛋白结构高度保守;GA可能通过负调控这3个成员参与葡萄果皮、果肉和种子区的发育,且3个成员均可能通过应答GA信号调控葡萄无核果实的发育。     

应用抑制消减杂交技术筛选葡萄冬芽和夏芽生理休眠相关基因

【目的】葡萄新梢上的芽有冬芽和夏芽两种,根据这两种芽休眠特性的差异,筛选与芽生理休眠相关基因,进而从分子水平研究葡萄芽生理休眠的相关机制。【方法】以‘赤霞珠’葡萄新梢上冬芽和夏芽为材料,夏芽作为驱动方（driver）,冬芽作为实验方（tester）,采用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）构建冬芽和夏芽的SSH-cDNA文库,筛选冬芽和夏芽差异表达的基因片段。通过NCBI同源比对,寻找与葡萄芽生理休眠相关的基因,并对差异表达基因进行功能注释和分类。最后,运用Real-time PCR技术对部分候选基因进行检测,以验证其与葡萄芽生理休眠的相关性。【结果】共获得359条有效、高质量的差异基因片段,经CAP3软件聚类拼接,得到106个unique EST。在GenBank中进行BLASTN同源比对,有98条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的92.4%。进行BLASTX同源比对,有54条EST与功能已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的51%。已知功能的EST涉及休眠、逆境胁迫、细胞代谢、胞内物质运输等方面,且绝大多数基因信息来源于葡萄、苜蓿、橄榄、油菜、高粱、棉花、大蒜、拟南芥等植物。对差异基因片段进一步的功能分析发现,调控开花的基因占生物学过程的20%;与环境胁迫相关的基因占生物学过程的6%;与细胞代谢相关的基因占生物学过程的20%;与胞内物质运输相关的基因占总生物学过程的6%;其他包括DNA转录、减数分裂、细胞死亡及细胞壁松弛作用等。这些基因的分子功能主要有半胱氨酸型肽链内切酶、甲基转移酶、蛋白激酶、催化活性、结构分子活性、蛋白结合功能、DNA结合功能、ATP结合功能、蛋白质二聚体催化活性及丙酮酸氨基转移酶活性等。经Real-time PCR检测得知,在夏芽萌发过程中,候选基因在冬芽和夏芽中表达量呈不规律变化,且同一基因在相同节位的冬芽和夏芽中表达量均有较大差异。【结论】发现了一些在冬芽中表达频率较高的基因,如编码MADS FLC-like蛋白、钙依赖蛋白激酶、NADP依赖型的苹果酸酶、细胞壁水解酶、细胞壁松弛蛋白、外被体蛋白β亚基、热激蛋白、衰老相关蛋白、细胞色素P450、细胞壁关联蛋白等基因,认为线粒体蛋白基因、未知蛋白基因、开花相关基因、ATP合成酶β亚基基因、MADs FLC-like蛋白基因等与葡萄芽生理休眠具有相关性。     

葡萄雌能花相关基因VvMS2的克隆及表达分析

【目的】从欧亚种葡萄‘魏可’和‘钟山红’的花中分离出VvMS2基因,为研究葡萄雌能花形成的分子机理和分子育种奠定基础。【方法】在NCBI中寻找与拟南芥雄性不育基因MS2同源性最高的葡萄序列（CBI29968）,设计特异引物进行克隆测序,通过生物信息学方法分析结构特征,利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在‘魏可’各组织中及‘魏可’和‘钟山红’雄蕊发育不同时期中的表达特性。【结果】VvMS2基因cDNA编码区全长为1 755 bp,编码584个氨基酸,含有NAD结合域和雄性不育C-末端区域。VvMS2对应基因组DNA全长2 776 bp,含有9个外显子和8个内含子。基因编码蛋白质分子量为64.74 kD,等电点为8.84。该基因与GenBank中其它来源的MS2蛋白序列的相似性为40%—71%。VvMS2为花蕾特异表达基因,且仅在花粉发育四分体期到二核期有表达,单核期‘魏可’的表达量显著高于同时期‘钟山红’。【结论】推测该基因异常表达与‘钟山红’葡萄雌能花形成有关。     

葡萄醛脱氢酶（ALDH2）基因进化、表达及启动子功能的生物信息学分析

【目的】研究葡萄醛脱氢酶ALDH2基因家族中ALDH2B4、ALDH2B8和ALDH2B9 3个成员的进化关系,对其在病原菌侵染、非生物胁迫及激素处理下的表达进行分析,为揭示ALDH2基因在植物逆境胁迫下的作用机理提供理论依据。【方法】运用生物信息学方法,鉴定葡萄ALDH蛋白序列;通过葡萄和拟南芥ALDH2基因的系统发育树、基因结构及同线性分析探讨其进化关系;利用葡萄Affymetrix芯片数据,分析葡萄ALDH2（ALDH2B4、ALDH2B8和ALDH2B9）基因在病原菌侵染、非生物胁迫和激素处理下的表达谱;采用在线软件PlantCARE分析3个葡萄ALDH2基因的启动子元件组成差异。【结果】在葡萄基因组中共鉴定出23个ALDH基因,并发现了ALDH2基因的可变剪接现象。基因结构分析结果表明,3个葡萄ALDH2基因的内含子/外显子组成高度相似,且均是通过大规模基因倍增产生的;仅有ALDH2B4具有剪接变体。葡萄与拟南芥的ALDH2基因位于同线区域,表明葡萄与拟南芥的ALDH2基因具有共同的祖先,ALDH2基因先于植物分化而存在。表达分析结果表明,VvALDH2B8是一个多病原菌和非生物胁迫响应基因,VvALDH2B4是一个渗透胁迫响应基因。葡萄的3个ALDH2基因的启动子区域均含有逆境胁迫响应元件,在VvALDH2B8上还发现了病原菌侵染响应元件Box-W1。【结论】葡萄的3个ALDH2基因虽然具有共同的祖先,但其在逆境条件下的表达差异很大,VvALDH2B8和VvALDH2B4可能在植物抵抗逆境胁迫中起重要作用。     

胞囊线虫侵染后小粒黑豆抑制消减杂交cDNA文库的构建及EST分析

【目的】研究胞囊线虫侵染后大豆根部早期基因表达情况,从分子水平探索大豆的抗病机制。【方法】以抗大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）3号生理小种的小粒黑豆（Glycine max）为材料,利用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）技术,构建大豆胞囊线虫诱导大豆根部早期表达的SSH-cDNA 文库,并结合反向Northern斑点杂交筛选阳性克隆。【结果】获得280个表达序列标签（EST）,经 CAP3 软件聚类拼接,得到166个unique EST,在GenBank进行Blastn与Blastx同源比对,有119条EST与已知蛋白或基因具有不同程度的同源性,占全部EST的83%,已知基因功能的EST涉及信号识别和传导、能量与物质新陈代谢、膜及转运、木质素和类黄酮的生物合成、抗病防御、细胞保护和转录调控。【结论】本研究在大豆胞囊线虫侵染早期发现了表达频率较高的基因如过氧化氢酶、泛肽素、几丁质酶、脂肪氧合酶、水通道蛋白、成熟调控蛋白、金属硫蛋白、脂膜嵌入蛋白、细胞色素P450和3-磷酸甘油醛脱氢酶等,并推测这些基因在大豆与胞囊线虫的非亲和互作过程中起重要作用。     

抗禽流感病毒免疫相关基因的筛选与鉴定

 【目的】研究抗禽流感病毒免疫的分子机制,发现新的抗禽流感病毒免疫相关基因,为抗禽流感转基因育种的研究奠定基础。【方法】随机选取40只30日龄AA白羽肉鸡,其中20只鸡注射禽流感H5亚型禽流感灭活疫苗,另20只未注射疫苗鸡作为对照,在注射后第9天取脾脏保存在液氮中。应用mRNA差异显示技术,结合反向northern dot blot鉴定技术,来筛选注射疫苗组和未注射疫苗组的差异表达基因。【结果】筛选出13条差异表达EST,其中未注射疫苗组4条,注射组9条表达量增高。应用BLAST工具将EST对核酸数据库nr和dbEST中所有序列进行了同源性分析。DD3、DD4、DD6、DD9、DD11、DD12与已有核酸数据库中的基因克隆或EST具有较高相似性,为已知的EST,但功能未知。DD10、DD13与鸡核糖体蛋白L7a基因具有很高的相似性。DD1、DD2、DD5、DD8为新的EST,提交到GenBank,分别获得登录号为EB714185、EB714186、EB714187、EB714188。【结论】本研究筛选出的鸡核糖体蛋白L7a基因和其它EST对应的未知功能基因可以作为抗禽流感病毒研究中的候选基因,其具体的功能有待今后进一步研究。     

大豆LEA基因家族全基因组鉴定、分类和表达

 【目的】鉴定大豆全基因组中的LEA家族基因,对其进行定位、分类以及组织表达分析,为植物LEA基因的功能研究与利用提供基础。【方法】利用大豆基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定并获得大豆LEA家族基因的全序列、定位和拷贝数信息;通过序列比对进行进化和分类分析;利用大豆发育表达芯片数据、NCBI中UniGene的EST表达数据进行组织表达谱分析。【结果】系统地分析鉴定了36个大豆的LEA家族基因,根据结构域的差异和系统发育分析将这些LEA基因分成8个亚家族。基因定位分析结果表明,这些基因分布于大豆的16条染色体上,启动子分析表明,几乎全部LEA基因的启动子区含有逆境反应顺式作用元件。各个发育阶段表达谱的分析结果表明,多数成员至少在一个组织中表达,10个差异表达的基因中有5个在种子发育时期优势表达,另外5个在其它部位优势表达。【结论】通过全基因组扫描,获得大豆基因组的36个LEA家族基因,它们分属于8个不同的亚家族,分布于16条大豆染色体上,启动子区含有逆境相关顺式作用元件,基因表达具有一定特异性。