绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1的克隆、表达谱分析及结合特征

 【目的】克隆、组织特异性表达以及荧光结合特征分析绿盲蝽 (Apolygus lucorum Meyer-Dür)化学感受蛋白（chemosensory protein,CSP）。【方法】设计特异性引物,用RT-PCR技术克隆绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,使用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术对AlucCSP1组织特异性表达进行研究,在BL2（DE3）工程菌株中用pGEX-4T-1载体进行原核表达,并在GSTrap FF柱中纯化和去标签蛋白。使用bis-ANS作为荧光配基,研究AlucCSP1蛋白与58种气味标样和5种棉花次生代谢物质的结合特征。【结果】得到了绿盲蝽化学感受蛋白基因,命名为AlucCSP1（GenBank登录号：JN573217）。该序列阅读框全长393 bp,编码130个氨基酸残基,N端有一段长17个aa的信号肽,具有4个保守的半胱氨酸残基。绿盲蝽AlucCSP1几乎全部在雌虫触角中表达。构建pGEX/AlucCSP1原核表达载体,在BL21（DE3）工程菌株中表达出分子量约为39 kD的融合蛋白,用亲和层析法纯化、经凝血酶作用去除标签蛋白获得纯化的AlucCSP1蛋白,该蛋白与棉酚、单宁、槲皮素、芦丁水合物亲和力较强,结合常数分别为13.4、32.7、19.7、38.5 μmol•L-1。【结论】克隆得到绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,在雌性触角内特异表达,并进一步得到约13 kD的AlucCSP1纯蛋白。为研究AlucCSP1在绿盲蝽化学感器中的作用奠定了基础。     

牧草盲蝽对七种寄主植物的趋性行为反应研究

【目的】研究牧草盲蝽对7种不同寄主植物的趋性行为。【方法】以牧草盲蝽为对象,通过Y型嗅觉仪及直接测定法,测定其对7种寄主植物的趋性行为反应。【结果】牧草盲蝽对灰绿藜及木地肤的选择性明显高于其它5种供试植物,选择反应率分别为64%和63%,其趋性程度也达到了显著水平;对棉花的趋性程度明显高于花椰菜、小白菜、田旋花三种供试植物,选择反应率均高于60%,均达到了显著水平;棉花与苜蓿二者之间的差异不显著。【结论】寄主植物挥发物在牧草盲蝽成虫选择寄主植物过程中起着重要的作用。     

中黑盲蝽在几种寄主植物上取食行为的比较研究

【目的】明确中黑盲蝽在主要寄主植物上的取食刺探行为,为评价寄主抗虫性和寄主选择习性提供方法和依据。【方法】通过EPG技术研究中黑盲蝽在菜豆、苜蓿、甘蓝和小麦以及棉花的生长点、子叶、真叶等器官上的取食特征。【结果】 中黑盲蝽在各寄主上的刺探电位波形由Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波和Ⅳ波4部分组成。Ⅰ波表示口针的刺入;Ⅱ波表示口针在撕裂植物组织和细胞,并向外分泌唾液;Ⅲ波表示取食;Ⅳ波表示口针的拔出。中黑盲蝽取食苜蓿和棉花生长点的每次刺探时间、每次刺探中的Ⅲ波时间均显著长于其它测试植物或器官。【结论】发现并定义了中黑盲蝽的四类刺探波（Ⅰ波、Ⅱ波、Ⅲ波、Ⅳ波）。通过比较EPG参数,发现在几种测试植物中,中黑盲蝽喜欢取食苜蓿,而在棉花植株上喜欢取食生长点。     

两种方法测定绿盲蝽气味结合蛋白AlucOBP21配体结合特性的结果比较

【目的】比较荧光竞争结合试验(fluorescence competitive binding assay)和微量热涌动(microscale thermophoresis,MST)技术在研究绿盲蝽(Apolygus lucorum)气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)Aluc OBP21配体结合特性上的差异,探索一种新的测定昆虫OBPs结合功能的方法。【方法】提取绿盲蝽雌、雄成虫触角总RNA并进行反转录,获得绿盲蝽成虫触角c DNA。采用特异性克隆引物,以绿盲蝽成虫触角c DNA为模板进行PCR扩增,构建p ET32a/Aluc OBP21重组质粒。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,获得含表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。通过高亲和Ni-NTA纯化介质对重组粗蛋白进行纯化,采用重组肠激酶切掉His-tag标签,最终获得无表达标签的重组Aluc OBP21蛋白。利用荧光竞争结合试验,以1-N-phenylnaphthylamine(1-NPN)为荧光探针研究重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,其中1-NPN和气味标样均溶解在质谱纯级的甲醇中。同时,利用MST技术解析重组Aluc OBP21蛋白与候选配体的结合特性,候选配体标样溶解在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液中。候选配体化合物包括8种潜在的盲蝽性信息素及性信息素类似物、12种植物绿叶挥发物和绿盲蝽驱避剂主要组分二甲基二硫醚等。【结果】重组Aluc OBP21蛋白在上清液和包涵体均能够表达,最终选择上清组分进行目标蛋白纯化,利用重组肠激酶在22℃切除His-tag标签得到无标签的重组Aluc OBP21蛋白。荧光竞争结合试验结果显示,重组Aluc OBP21与荧光探针1-NPN的解离常数为(6.88±0.31)μmol·L~(-1),Aluc OBP21能够与β-紫罗兰酮和β-石竹烯结合,解离常数分别为(13.74±1.93)和(13.24±2.12)μmol·L~(-1),而其他候选配体均不能与重组Aluc OBP21有效结合。MST测试结果显示,Aluc OBP21可以与β-石竹烯、β-紫罗兰酮、β-蒎烯和柠檬烯有效结合,解离常数分别为(0.20±0.02)、(0.05±0.01)、(0.70±0.04)和(0.40±0.06)μmol·L~(-1)。其余候选配体化合物与Aluc OBP21的热涌动不能随配体浓度变化而表现有规律的变化,故这些气味化合物不能与Aluc OBP21发生结合作用。【结论】MST检测与荧光竞争结合试验相比,MST所得配体结合谱更广,不会遗漏一些结合力较弱的气味配体。     

桃小食心虫化学感受蛋白CSP16配体结合特性

【目的】桃小食心虫（Carposina sasakii）是我国北方果树生产中的重要害虫之一,本文通过体外表达桃小食心虫化学感受蛋白CsasCSP16,明确其与寄主挥发物分子和性信息素分子的结合特性,并通过生物信息学预测CsasCSP16与挥发物分子结合的关键氨基酸位点,为揭示桃小食心虫嗅觉的分子机理提供理论依据。【方法】通过原核表达系统获得CsasCSP16蛋白,并使用Ni-NTA柱纯化重组蛋白。采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-pheny-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,从33种寄主挥发物和2种性信息素分子中筛选出与CsasCSP16结合亲和性高的配体分子。通过对CsasCSP16进行同源建模获得其三维结构模型,以CSPMbraA6（PDB ID：1N8U）为模板成功构建CsasCSP16的三维结构模型。使用Autodock Vina软件将CsasCSP16与亲和性高的配体分子进行对接,构建蛋白-配体复合物。然后使用GROMACS（2019.3）软件对复合物进行动力学模拟,从动力学模拟的平衡状态中选取100个构象,使用g_mmpbsa软件计算CsasCSP16与气味分子的结合能,并通过能量分解的方法预测关键氨基酸残基。【结果】成功构建了CsasCSP16的克隆表达载体,通过大肠杆菌原核表达系统获得高纯度的重组蛋白。与35种配体分子的荧光竞争结合表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯有较强的结合活性,其Ki值分别为6.59、6.25、3.50、6.73和4.47 μmol·L^-1。分子对接的结果表明,CsasCSP16与水杨酸甲酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、十五烷、庚酸丁酯和α-蒎烯的Vina Score值分别为-6.1、-5.3、-5.8、-5.2和-6.6。动力学模拟结果表明,CsasCSP16与气味分子复合物在50 ns内达到平衡状态,通过g_mmpbsa计算复合物的结合能,CsasCSP16-水杨酸甲酯、CsasCSP16-6-甲基-5-庚烯-2-酮、CsasCSP16-十五烷和CsasCSP16-庚酸丁酯的结合自由能分别为-50.264、-65.551、-136.035和-93.805 kJ·mol^-1;最后,通过分解每个氨基酸贡献的结合自由能表明异亮氨酸49（Ile49）、缬氨酸71（Val71）、异亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）贡献的结合能>3 kJ·mol^-1,因此推测这4种氨基酸在CsasCSP16结合气味分子的过程中发挥关键作用。【结论】桃小食心虫CsasCSP16能与寄主植物的多种气味分子结合,推测其可能在桃小食心虫对寄主植物的定位过程中发挥重要作用。异亮氨酸49（Ile49）、缬氨酸71（Val71）、异亮氨酸72（Ile72）和酪氨酸90（Tyr90）可能是CsasCSP16与配体分子结合的关键氨基酸位点。     

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）;该基因cDNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物polyA加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 kD,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74-83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高,其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP,表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经FoccOBP1蛋白的二级结构预测,FoccOBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。     

杀虫剂对褐飞虱捕食性天敌黑肩绿盲蝽的安全性评价

 【目的】评估7类14种杀虫剂对褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）的重要捕食性天敌黑肩绿盲蝽Cyrtohinus lividipennis (Reuter)成虫、若虫和卵的安全性。【方法】在室内条件下,用药膜法、稻株喷雾法及稻茎浸渍法测定杀虫剂对黑肩绿盲蝽的安全性。【结果】药膜法测定结果表明氟虫腈、噻虫嗪和异丙威3种杀虫剂对成虫不安全（Ⅳ级）,LC50值为0.20～0.74 mg a.i.•L-1;氟硅菊酯、醚菊酯对成虫安全（Ⅰ级）,LC50值＞160.0 mg a.i.•L-1。稻株喷雾法测定结果表明噻嗪酮在药后1d对成虫安全（Ⅰ级）,死亡率为1.7％;在药后4～10 d,丁硫克百威、氟虫腈、噻虫嗪、吡虫啉为较不安全或不安全（Ⅲ级或Ⅳ级）,死亡率为70.0%～100.0%。稻茎浸渍法测定结果表明除噻嗪酮和阿维菌素外,其余供试杀虫剂均对黑肩绿盲蝽若虫不安全（Ⅳ级）。稻株喷雾法测定结果表明醚菊酯、阿维菌素、氟硅菊酯、敌敌畏、噻嗪酮对卵安全（Ⅰ级）,孵化抑制率＜20%,而丁硫克百威对卵较不安全（Ⅲ级）,孵化抑制率为52.24%。【结论】IGR类噻嗪酮对黑肩绿盲蝽各虫态均很安全,其它供试杀虫剂对黑肩绿盲蝽的安全性因杀虫剂和虫态的不同而异。     

双斑长跗萤叶甲取食玉米叶片的挥发物分析

【目的】分析双斑长跗萤叶甲取食前后的玉米叶片挥发物组成和含量,为进一步研究玉米叶片挥发物对双斑萤叶甲的防御机制提供科学依据。【方法】采用固相微萃取和气相色谱-质谱联用仪检测并分析健康玉米叶片及双斑长跗萤叶甲不同取食时间(6、24、36和48 h)下玉米叶片挥发物组分变化。【结果】双斑长跗萤叶甲取食0、6、24、36和48 h后,分别检测到29、30、33、36、26种挥发物,主要为醛类、萜类、醇类及酮类等化合物。1-石竹烯、顺-11-十六醛、α-石竹烯、正己醛等20种挥发物随该虫取食为害后消失;新收集到2-己烯醛、(E)-2-己烯醛、α-蒎烯、β-月桂烯等42种化合物。α-蒎烯、2-己烯醛、β-蒎烯等物质是虫害6及24 h释放的主要化合物;十六醛、十四醛、正十五碳醛、β-紫罗酮、(E)-3-己烯-1-醇是虫害36 h释放的主要化合物;β-红没药醇、橙花叔醇、(1R)-α-蒎烯、β-罗勒烯、β-檀香烯、β-月桂烯、葎草烯是虫害48 h释放的主要化合物。【结论】双斑长跗萤叶甲不同时间取食玉米叶片的挥发物的组分和含量影响较大,取食6及24 h主要释放烯烃类化合物,取食36 h主要释放醛类和酮...     

绿盲蝽对寄主转换的适应性及生理响应

【目的】明确绿盲蝽在不同寄主植物之间转换后的适应性与生理响应机制。【方法】采用昆虫试验种群生命表方法,系统测定用四季豆饲养2代后的绿盲蝽分别转换到豇豆、绿豆、鄂杂棉10号（Bt棉）和苏棉9号（非Bt棉）上的种群生长发育与繁殖等生命表参数,并分析不同供试寄主饲养的绿盲蝽成虫体内的淀粉酶、蛋白酶及海藻糖酶活性和海藻糖含量。【结果】绿盲蝽由四季豆转移到不同供试寄主植物上均可完成世代循环,但不同龄期若虫的发育历期与存活率、5龄若虫体重及成虫寿命与产卵量等差异显著。不同供试寄主饲养的绿盲蝽种群趋势指数值依次为：四季豆（16.56）﹥Bt棉-鄂杂棉10号（3.23）﹥常规棉-苏棉9号（2.14）﹥豇豆（1.67）﹥绿豆（1.31）。不同供试寄主饲养的绿盲蝽成虫体内的几种酶活性也存在较大差异。转基因棉（鄂杂棉10号）种群的海藻糖酶活性最高（3.74 μg•mg-1•min-1）,而海藻糖含量最低（3.03 μg/adult）。【结论】绿盲蝽由四季豆转换到其它4种寄主后,其生长发育速率与种群趋势增殖指数等生命参数均有所下降,成虫体内的蛋白酶、淀粉酶、海藻糖酶活性及海藻糖含量也有显著差异。总体相对比较而言,绿盲蝽对棉花具有较高的适应性。     

棉花营养物质和单宁含量与其对绿盲蝽抗性的关系

【目的】系统研究不同棉花品种对绿盲蝽的抗性水平,并在室内测定不同棉花品种不同生育期以及不同组织的蛋白质、可溶性糖和单宁物质的含量,旨在明确棉花体内这些物质与品种抗性的关系。【方法】以12个棉花品种为材料,通过连续2年田间抗性鉴定确定这些棉花品种的抗性水平;然后分别采用Bradford法、蒽酮-硫酸法和香草醛法通过室内试验测定不同棉花品种各生育期不同组织蛋白质、可溶性糖和单宁的含量;最后进行12个棉花品种蛋白质、可溶性糖和单宁含量与其对绿盲蝽抗性的相关性分析。【结果】不同棉花品种对绿盲蝽抗性水平存在明显差异,其中云南黄绒土棉和美中棉为高抗品种（综合抗性指数＜1）,AH-510、苏联棉、荆7516-1和池州红叶棉为高感品种（综合抗性指数＞3）。棉蕾和棉铃中蛋白质含量随着棉花对绿盲蝽抗性的增强而降低;可溶性糖含量在苗期顶叶中随着棉花对绿盲蝽抗性的增强而增加,但在棉蕾中随着棉花对绿盲蝽抗性的增强而降低;单宁含量在棉蕾中随着棉花对绿盲蝽抗性的增强而降低,但在铃期顶叶中随着棉花对绿盲蝽抗性的增强而增加。【结论】12个棉花品种中云南黄绒土棉对绿盲蝽抗性最强,池州红叶棉对绿盲蝽抗性最弱。蕾期棉蕾及铃期棉铃中蛋白质含量与其对绿盲蝽抗性存在显著负相关;苗期顶叶中可溶性糖含量和其对绿盲蝽抗性呈显著正相关,而蕾期棉蕾中可溶性糖含量和其对绿盲蝽抗性呈显著负相关;蕾期棉蕾中单宁含量和其对绿盲蝽抗性呈显著负相关,而铃期顶叶中单宁含量和其对绿盲蝽抗性呈显著正相关。     

中华蜜蜂普通气味结合蛋白ASP2的气味结合功能模式分析

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）体外重组普通气味结合蛋白AcerASP2与不同气味信息的结合功能和模式。【方法】通过诱导条件的优化和纯化,在获得的重组AcerASP2蛋白基础上,研究竞争性荧光探针1-NPN及不同结构气味信息与蛋白的相互作用关系,并通过同源建模和分子对接解析蛋白与气味信息的结合模式和机理。【结果】通过条件摸索获得了可溶性表达的重组中蜂ASP2蛋白,荧光光谱分析1-NPN与AcerASP2的解离常数K1-NPN为7.38 μmol•L-1,结合位点数n为1.0321。在7种气味信息中,4-烯丙基藜芦醚亲和力最强,其IC50和解离常数KD分别达到7.09和3.46 μmol•L-1。分子对接显示AcerASP2具有1个呈狭长的口袋状的疏水性结合内腔,4-烯丙基藜芦醚绝大部分位于该预测疏水性内腔中,且与Lys74产生2个氢键。【结论】中华蜜蜂AcerASP2由于特殊的空间结构而具有较强的气味信息结合能力,且易通过与疏水内腔中的赖氨酸残基产生氢键而促进结合。     

鸡钙离子结合分子伴侣Calreticulin的结构与功能预测及组织表达特性

【目的】揭示鸡组织细胞内质网(endoplasmic reticulum, ER)中关键Ca²⁺结合分子伴侣钙网蛋白(calreticulin, CRT)的结构与功能及组织表达特性。【方法】应用Laser Gene软件,通过比对Gene bank已登录的12种脊椎动物CRT核苷酸及氨基酸序列以分析其进化关系,利用生物信息学方法预测鸡CRT蛋白的结构与功能,并采用荧光定量RT-PCR方法检测CRT在鸡30个不同组织中的表达特性。【结果】同源性分析结果显示：鸡与其他11个物种CRT基因核苷酸序列中,鸡与兔核苷酸序列同源性最高,为78.7%,与虹鳟的同源性最低,为70.5%;氨基酸序列中,鸡与蛇的亲缘关系最近,为85.0%,与虹鳟的亲缘关系最远,为69.0%,与鼠、猕猴、人、兔、猪、牛和非洲爪蟾蜍的亲缘关系也相对较近,并均在80.1%及以上。蛋白结构与功能预测结果为：鸡CRT由404个氨基酸组成,相对分子质量46.8802 kD,理论等电点为4.41,负电荷氨基酸残基数为102,正电荷氨基酸残基数为53,分子式为C₂₀₇₄H₃₁₀₇N₅₄₃O₆₈₄S₉,鸡CRT具有22个疏水区域,其C端与N端具有很高的疏水性,而C端的亲水性要强于N端,且形成α_1(7-17)-α_2(22-25)-β₁₍₂₆₎-β_2(38-41)-β_3(50-54)-β_4(69-70)-β_5(75-82)-β_6(92-99)-β_{7 (110-114)}-β_8(129-133)-β_9(144-151)-β_10(171-178)-β_11(183-187)- β_12(314-322)-β_13(326-332)-α_3(337-348)-α_4(350-375)-α_5(377-379)-α_6(395-401)的二级结构。CRT蛋白属于跨膜蛋白,存在信号肽,且为分泌蛋白,酶分类属于EC 3.2.1.55或EC 3.4.24.68。组织表达检测结果表明：CRT基因在鸡各组织中广泛表达,其中在回肠、腺胃和十二指肠等组织中表达量较高,且高出肾脏（对照）20倍以上。【结论】鸡CRT核苷酸及氨基酸序列在12种脊椎动物物种中具有相对保守性,鸡CRT为跨膜分泌蛋白,为酸性蛋白,属于α-N-阿拉伯糖苷酶或Tentoxilysin,催化α-L-阿拉伯糖苷内的终端非还原性α-L-阿拉伯呋喃糖苷残基的水解,作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含（1,3）和/或（1,5）糖苷键的阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖,能与糖类分子及Ca²⁺特异性结合,可监控糖蛋白组装折叠及Ca²⁺调控,且在消化系统中发挥重要作用。     

异三聚体G蛋白在UV-B诱导拟南芥气孔关闭中的作用

【目的】了解异三聚体G蛋白在紫外线B（UV-B）辐射诱导气孔关闭中的作用,为进一步阐明植物细胞转导UV-B辐射信号的机制提供依据。【方法】以拟南芥（Arabidopsis thaliana）野生型、G蛋白α亚基基因缺失突变体及其超表达株系和组成活化型株系为材料,并结合药理学试验,通过气孔开度分析确定G蛋白在0.5 W•m-2 UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭中的作用。【结果】细菌毒素试验表明,G蛋白抑制剂百日咳毒素（PTX）能显著抑制UV-B诱导的气孔关闭,而其活化剂霍乱毒素（CTX）能模拟UV-B的作用诱导可见光下叶片气孔关闭。遗传学试验显示,UV-B不能诱导异三聚体G蛋白α亚基GPA1功能缺失突变体gpa1-1和gpa1-2的气孔关闭,却能诱导其超表达株系wGα和组成活化型株系cGα的气孔关闭,且cGα在可见光下气孔开度明显小于野生型,在UV-B辐射初期其气孔关闭速度明显快于野生型。【结论】异三聚体G蛋白α亚基参与了UV-B辐射诱导拟南芥叶片气孔关闭的信号转导过程。     

美洲斑潜蝇气味结合蛋白OBP13的鉴定与功能

【目的】克隆与鉴定美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）基因,并对其序列特征、表达情况、系统发育及蛋白功能进行研究,为深入研究美洲斑潜蝇嗅觉机制提供依据。【方法】通过PCR技术克隆美洲斑潜蝇OBP13编码区全长,用DNAMAN对其进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并使用MEGA6.0构建进化树,进行系统发育分析。通过实时定量PCR对OBP13在美洲斑潜蝇不同组织中的表达情况进行分析。构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化,获取重组蛋白。设定荧光分光光度计的激发波长为337 nm,以1-NPN为荧光探针,研究OBP13与25种不同气味配基的结合特性。使用间接免疫荧光染色技术及制备的OBP13的特异性多克隆抗体,对其在组织中的分布情况进行定位。将美洲斑潜蝇触角进行包埋、切片、免疫染色,并在激光共聚焦显微镜下进行观察,了解OBP13在触角感器中的亚细胞分布。【结果】获得了一个美洲斑潜蝇气味结合蛋白基因,命名为LsatOBP13（GenBank登录号：KT250751）。LsatOBP13开放阅读框全长462 bp,编码153个氨基酸,预测成熟蛋白分子量为17.80 kD,等电点为5.75,N-末端的前17个氨基酸为信号肽序列。具有4个保守的半胱氨酸位点,为Minus-C OBP。系统发育分析显示,其与地中海实蝇CcapOBP99a-like位于同一小分支上,亲缘关系较近。检测LsatOBP13在不同组织的表达水平,发现LsatOBP13在触角中的表达量远远高于其他组织。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。对25种气味配基的结合能力检测,发现LsatOBP13与反式-2-己烯醛、芳樟醇、1-辛烯-3-醇、α-紫罗兰酮、苯并噻唑、β-紫罗兰酮具有较强的结合能力,解离常数分别为12.592、10.995、11.165、11.224、10.336、9.218 μmol·L^-1,其中与β-紫罗兰酮亲和能力最强。通过免疫荧光定位,发现其在触角中主要定位在毛形感器和锥形感器上,在触角嗅觉窝及触角芒连接处也有分布。【结论】美洲斑潜蝇OBP13为非典型的气味结合蛋白Minus-C OBP。表达情况、气味结合特性、免疫定位结果表明,OBP13主要存在于美洲斑潜蝇触角中,参与触角对绿叶植物中大量存在的气味物质的识别过程,推测其在美洲斑潜蝇嗅觉识别、寄主植物定位中发挥功能。     

桉蝙蛾幼虫对桉树树干及其林下浅层土壤挥发物的嗅觉行为反应

【目的】通过比较健康和受桉蝙蛾幼虫危害的桉树树干及其林下浅层土壤挥发物的组成与含量,探究桉蝙蛾幼虫由地栖环境向树栖危害的转移机制,为其生态防治提供理论依据。【方法】采用动态顶空吸附法提取健康和受桉蝙蛾幼虫危害桉树树干及其林下浅层土壤挥发物,利用气相色谱—质谱联用仪（GC-MS）测定挥发物的组分及含量,通过随机森林算法分析,选择5种挥发物用于测定桉蝙蛾幼虫的嗅觉行为反应。【结果】从健康和受害桉树树干及浅层土壤中分别鉴定出17、47和23种挥发物。随机森林分析结果显示,健康与受害树干挥发物的比较中,左旋-β-蒎烯、3,3-二甲基-6-亚甲基环己烯和左旋-α-蒎烯的重要性较高;桉树树干（健康及受害）与浅层土壤挥发物的比较中,左旋-β-蒎烯、莰烯、桉叶油醇、邻伞花烃、3,3-二甲基-6-亚甲基环己烯和左旋-α-蒎烯的重要性较高。行为测定结果显示,莰烯和邻伞花烃（浓度10 mg/mL）分别对桉蝙蛾3龄幼虫具有显著（P<0.05）和极显著（P<0.01）的引诱作用。【结论】桉树树干挥发物中的邻伞花烃和莰烯均可显著吸引桉蝙蛾3龄幼虫,且均在受害桉树树干挥发物中含量更高,推测二者对桉蝙蛾幼虫寻找寄主植物的行为具有调控作用。     

亚洲玉米螟GOBP2的克隆、原核表达及多克隆抗体制备

 【目的】克隆、序列分析和原核表达亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）GOBP2（OfurGOBP2)的cDNA。【方法】以亚洲玉米螟触角为材料,采用RT-PCR结合RACE方法克隆OfurGOBP2的cDNA序列,并在pGEX-4T-2/BL21（DE3）系统中进行原核表达, 进一步利用制备的抗体检测OfurGOBP2蛋白。【结果】从亚洲玉米螟触角中获得了GOBP2的cDNA序列（GenBank登录号为DQ673101）,序列分析表明,OfurGOBP2开放阅读框489 bp,编码162个氨基酸残基,氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸位点,具有气味结合蛋白的典型特征。一致性分析显示,OfurGOBP2与其它鳞翅目昆虫GOBP2编码的氨基酸一致性较高,表明昆虫的GOBP2在分子进化过程中是保守的。进一步将OfurGOBP2与表达载体pGEX-4T-2连接,转入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为41 kD的可溶性融合蛋白。SDS-PAGE分析和Western印迹检测结果表明,OfurGOBP2能够高效表达,并与预测的融合蛋白分子量相符。利用制备的多克隆抗体对亚洲玉米螟GOBP2进行Western-blot分析,证明其能够特异识别OfurGOBP2蛋白。【结论】成功克隆了编码并表达亚洲玉米螟气味结合蛋白GOBP2 的cDNA序列,并制备了多克隆抗体,可用于深入研究亚洲玉米螟GOBP2的结构和功能。     

双斑长跗萤叶甲成虫对α-红没药醇等棉花和玉米挥发物的嗅觉行为反应

【目的】 筛选对双斑长跗萤叶甲Monolepta hieroglyphica (Motschulsky)成虫有引诱或趋避活性的植物挥发物。【方法】利用“Y”型嗅觉仪测定对双斑长跗萤叶甲有引诱或趋避作用的挥发物。【结果】10 μg/mL的α-红没药醇和α-蒎烯对双斑长跗萤叶甲雌雄成虫有明显的引诱作用,配方1、2、6对双斑长跗萤叶甲雄成虫有明显的引诱作用,配方2、6对双斑长跗萤叶甲雌成虫有明显的引诱作用。【结论】10 μg/mL的α-红没药醇和α-蒎烯对双斑长跗萤叶甲有明显的引诱趋性,可作为该叶甲的引诱剂成分。     

斜纹夜蛾普通气味结合蛋白ⅠcDNA的克隆及在原核细胞中的表达

 【目的】克隆、序列分析和原核表达编码斜纹夜蛾（Spodoptera litura）GOBPⅠ（SlGOBPⅠ）的cDNA。【方法】采用同源克隆结合RACE的方法克隆SlGOBPⅠ基因的cDNA序列,并在 pET-32a/BL21（DE3）系统中进行原核表达。【结果】从斜纹夜蛾触角中克隆了GOBPⅠ的cDNA序列（GenBank登录号为EU086372）,序列分析表明,SlGOBPⅠ开放阅读框序列为495 bp,编码164个氨基酸,分子量为19.3 kD,等电点为5.54。SlGOBPⅠ具有昆虫气味结合蛋白的典型特征,即氨基酸序列中具有 6个半胱氨酸残基,呈酸性。SlGOBPⅠ氨基酸序列与鳞翅目昆虫的气味结合蛋白氨基酸序列具有较高的相似性,表明SlGOBPⅠ属于GOBP家族。将SlGOBPⅠ编码序列,克隆到表达载体pET-32 a上,构建原核表达载体pET-SlGOBPⅠ,在表达宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了相对分子质量为32.0 kD的可溶性融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和柱一步纯化了SlGOBPⅠ融合蛋白,以此融合蛋白免疫新西兰大白兔制备了SlGOBPⅠ的抗血清,ELISA滴度为1﹕5 000,Western印迹检测结果显示,SlGOBPⅠ抗血清与表达的融合蛋白质呈阳性反应,表明所表达的融合蛋白保持原有的免疫原性。【结论】克隆、分析和表达了编码斜纹夜蛾气味结合蛋白GOBPⅠcDNA 序列,为今后深入研究斜纹夜蛾GOBPⅠ基因的结构和功能奠定了基础。     

5种绿篱植物挥发性有机化合物成分分析

为了探讨不同植物释放挥发性有机物(VOCs)组分和含量的差异,采用动态顶空采集法和热脱附-气相色谱-质谱(TDS-GC-MS)联用技术,分析了近自然状态下杭州地区常用绿篱植物金叶女贞Ligustrum quihoui var.aureaphylla,红花檵木Loropetalum chinese var.rubrum,瓜子黄杨Buxus sinica,龟甲冬青Ilex crenata‘Convexa’和无刺枸骨lles cornuta var.fortunei释放VOCs的种类和相对含量.结果表明:瓜子黄杨释放的VOCs主要有乙酸-3-己烯酯(相对含量为27.10％),芳樟醇(19.70％),2-辛烯(7.20％);红花檵木释放的挥发性物质主要有乙酸-3-己烯酯(26.10％),α-蒎烯(6.70％),苯甲醛(6.50％);金叶女贞主要有乙酸-3-己烯酯(16.30％),苯甲醛(8.30％),壬醛(5.50％)和对甲基苯乙烯(5.10％);无刺枸骨主要有β-蒎烯(12.10％),癸醛(9.50％),2-壬烯醇(7.40％),月桂烯(7.20％),苎烯(6.50％),2-辛烯(6.10％)和6-甲基-5-庚烯-2-酮(6.01％);龟甲冬青主要有癸醛(21.60％),壬醛(13.60％),已内酰胺(6.80％)和苯甲醛(5.60％).