BMP2和BMP4基因在草原红牛睾丸组织中的表达量分析

采用实时荧光定量PCR技术检测BMP2和BMP4基因在草原红牛1,12,18,30月龄4个发育阶段睾丸组织中的mRNA表达水平。旨在探讨该基因在草原红牛睾丸不同发育阶段的表达情况。结果表明:BMP2和BMP4基因在所检测的肉牛4个发育阶段睾丸组织中均有表达。BMP4基因1月龄表达量显著低于12,18,30月龄(P0.05),12月龄表达量最高,随着月龄增加,表达量减少。而BMP2基因在出生阶段表达量最低,但是与其他3个阶段差异不显著(P0.05),基因表达趋势也是12月龄表达量最高,然后随着月龄增加,表达量减少。     

牦牛TNP2基因分子特征及其在不同发育阶段睾丸中的表达

克隆牦牛过渡蛋白2(transition protein 2,TNP2)基因并分析其分子特征,调查TNP2基因和蛋白在不同发育阶段牦牛睾丸中的表达差异,为研究其在睾丸发育及精子发生中的作用提供依据.采集不同发育阶段牦牛睾丸(初生期、幼年期、性成熟初期、性成熟后期、老年期)组织,在克隆测序的基础上对TNP2基因进行分子特...     

鸭Mef2bnb基因的克隆及其mRNA丰度在肌肉组织中的发育性表达变化

旨在克隆鸭肌肉增强因子2b邻居基因(Myocyte enhancer factor 2Bneighbor,Mef2bnb)的cDNA全序列,并对其进行分析,研究该基因在肌肉组织中的发育性表达规律。利用RACE技术从鸭腿肌中克隆出Mef2bnb的全长cDNA序列,应用Q-PCR技术检测了自鸭胚胎10d至出壳1周肌肉组织中Mef2bnb基因的发育性表达。结果显示:该序列全长935bp,包括5′非编码区(5′UTR)51bp和3′非编码区(3′UTR)518bp,完全开放阅读框(ORF)366bp,可编码121个氨基酸残基,结构分析表明,该肽链没有信号肽,第1～117号氨基酸为鸭Mef2bnb基因与其它动物高度保守的NEP结构域;Mef2bnb基因在胸肌、腿肌和心脏3种肌肉组织中不同阶段均有不同程度的表达,而其在胸肌中的表达量均高于同时期在腿肌中的表达量,推测鸭Mef2bnb基因可能具有促进Ⅱ型纤维形成的功能,另外该基因在心脏的高表达表明其可能与心脏的发育有关。本研究结果将为进一步研究鸭Mef2bnb结构及其在肌肉组织中的作用奠定基础。     

猪瘟基因疫苗在小鼠肌肉中的动态分布表达

本研究应用原位杂交法、免疫组化、PCR法对肌肉注射猪瘟基因疫苗pcDST、pcDSW后小鼠胫前肌中质粒存在的方式、部位及时间进行了动态观察，结果表明猪 病毒基因疫苗注射3h后质粒就到达细胞核，至20d在细胞核内仍呈阳性反应；pcDST质粒在肌肉内存在120d，pcDSW质粒在肌肉存在150d;pcDST质粒肌肉注射后第3d，pcDSW质粒肌肉注射后第5d，在胫前肌肌肉中可检测到表达产物，持续表达20d以上。表明构建的猪瘟基因疫苗经肌肉注射是较好的免疫途径。     

家蚕丝蛋白基因在不同发育时期表达量的变化

本文采用半定量RT-PCR方法,检测了家蚕4～5龄期丝腺中5个丝蛋白基因(Fib-H、Fib-L、Ser-2短片段、Ser-2长片段、Ser-3)在不同发育时期表达量的变化。结果表明,Fib-H、FIB-L及Ser-3基因的表达规律相似,总体上4龄期表达量明显低于5龄,但4龄眠期均有明显表达,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,至熟蚕或熟蚕后2d达到高峰,此后迅速下降;Ser-2基因两个转录本的表达规律基本一致,与以上3个基因相比,Ser-2基因在4龄期存在相对较高的表达量,但在4龄眠期表达量明显降低,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,Ser-2短片段和长片段分别从5龄96h和144h之后表达量开始降低,到熟蚕期基本达到最低值。     

Bcl-2、PCNA基因在鸡、鹌鹑及其杂交种睾丸组织中的表达研究

为探讨鸡（♂）与鹌鹑（♀）属间杂交种睾丸生长发育不良的分子机理,试验采集新罗曼蛋用型公鸡、朝鲜公鹌鹑、鸡与鹌鹑的雄性杂交种不同发育时期的睾丸组织样共计84份,并用实时荧光定量PCR对公鸡、公鹌鹑及其杂交种各阶段睾丸组织中Bcl-2、PCNA基因的mRNA表达进行了检测。结果显示,鸡和鹌鹑不同生长发育期睾丸组织中Bcl-2、PCNA基因mRNA的表达具有相似性,Bcl-2基因整体呈波动性变化,下降到最低值后,迅速回升到较高水平,PCNA基因均有一个极显著的峰值;与鸡和鹌鹑相比,杂交种Bcl-2、PCNA基因mRNA表达均无明显变化,表明杂交种睾丸发育过程中,Bcl-2基因调控睾丸中细胞凋亡的模式不同于鸡和鹌鹑,也不存在明显的细胞增殖过程,从而推测鸡与鹌鹑的杂交种睾丸生长发育不良的分子影响因素与其睾丸组织中Bcl-2、PCNA基因mRNA的异常表达有关。本试验结果为进一步研究鸡与鹌鹑属间杂交种睾丸发育不良的分子机理提供了参考依据。     

藏猪睾丸DNA甲基化与HIF2α基因mRNA表达水平的相关性

对藏猪睾丸组织基因组DNA甲基化水平与Dnmt3a、HIF2α基因mRNA表达水平的相关性进行研究。以大约克猪为对照,采用荧光法测定藏猪睾丸组织基因组DNA甲基化水平,采用实时荧光定量PCR技术测定DNA甲基化转移酶3a(Dnmt3a)与低氧诱导因子2α(HIF2α)的基因在藏猪睾丸组织中mRNA表达水平。结果显示:藏猪睾丸基因组DNA甲基化水平(0.392 9±0.099 2)%显著低于大约克猪睾丸基因组DNA甲基化水平(0.901 7±0.146 7)%(P<0.05);藏猪睾丸组织中Dnmt3a基因mRNA相对表达量(0.071 6±0.036 6)%显著低于大约克猪睾丸组织中Dnmt3a基因mRNA相对表达量(0.987 8±0.137 0)%(P<0.05);藏猪HIF2α基因mRNA相对表达量(0.158 8±0.066 1)%也显著低于大约克猪HIF2α基因mRNA相对表达量(1.2930±0.0756)%(P<0.05)。通过对藏猪睾丸基因组DNA甲基化水平与该组织中Dnmt3a和HIF2α基因mRNA表达量进行相关性分析,发现存在线性正相关,R2值分别达到0.846 3和0.917 4,这将为藏猪睾丸低氧适应性的DNA甲基化机制及藏猪的分子育种等相关研究奠定基础。     

Ghrelin在BALB/c小鼠胸腺中的定位分布与发育性表达

本试验应用免疫组织化学方法和显微图像分析技术,探讨了Ghrelin在1、3、5、6、12月龄BALB/c小鼠胸腺中的定位分布和发育性表达规律。结果表明,Ghrelin免疫阳性反应主要分布于胸腺髓质内,而胸腺皮质中较少。Ghrelin阳性细胞类型包括被膜下胸腺上皮细胞、星形胸腺上皮细胞、髓质胸腺上皮细胞、胸腺小体上皮细胞、巨噬细胞、胸腺髓质的部分淋巴细胞,可能还有胸腺树突状细胞。Ghrelin在小鼠胸腺中的表达量,1、3月龄之间差异不显著(P0.05),5、6月龄之间差异也不显著(P0.05),但5、6月龄显著低于1、3月龄(P0.05),而12月龄又显著低于5、6月龄(P0.05)和极显著低于1、3月龄(P0.01),即随着年龄的增长,胸腺中的Ghrelin表达量逐渐减少。结果提示,胸腺的年龄性退化可能与Ghrelin的表达量下降有关。     

睾丸发育过程概述及生殖生物学研究意义

睾丸是雄性哺乳动物的生殖器官,其基本功能是产生精子和分泌雄激素。生产实际中睾丸大小可以作为家畜早期育种选择的有效途径。本文就睾丸发育过程进行简单阐述,此外,对睾丸大小生殖生物学意义进行阐述,以期为后期家畜育种提供有效的理论依据。     

兴义鸭MEF2A基因mRNA在组织中表达研究

运用RT-PCR和qRT-PCR对兴义鸭NEF2A基因在不同组织中的表达量进行探究。结果表明,心、肝、肺、肾、十二指肠、大脑、胸肌、腿肌、肌胃、腺胃共10个组织中均检测到了MEF2A基因mRNA的表达,说明该基因属于广谱表达基因;同时,还发现该基因呈依赖性组织表达,大脑中的表达量最高,消化器官中表达量相对最低,如肌胃和腺胃。研究结果为兴义鸭组织表达谱构建奠定了基础。     

血红素氧合酶-2基因真核表达载体的构建

为构建血红素氧合酶-2（HO-2）真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,并观察其在小鼠脑血管内皮细胞中的表达情况。试验利用PCR技术从C57BL/6小鼠海马组织中扩增出HO-2基因cDNA序列,用双酶切法将此序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP上,构建HO-2的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP,重组载体经EcoRI和BamHI双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染小鼠脑血管内皮细胞,48h后,实时定量PCR、Western blot检测HO-2在小鼠脑血管内皮细胞中mRNA和蛋白质水平的表达情况。结果表明,pEF1α-HO-2-AcGFP载体构建正确;重组载体转染小鼠脑血管内皮细胞后HO-2在mRNA水平表达量较空载体转染极显著增高（P〈0.01）,在蛋白水平表达量较空载体转染显著增高（P〈0.05）。表明HO-2基因的真核表达载体pEF1α-HO-2-AcGFP构建成功,为进一步研究其机制和功能奠定了基础。     

Legumain基因在斑马鱼胚胎发育中的表达分析

为明确天冬酰胺内肽酶(legumain)基因在斑马鱼发育中的表达特性,利用全胚胎原位杂交的方法检测legumain在斑马鱼胚胎发育过程中的表达分布情况,并采用双色原位杂交的方法研究legumain和泛髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的共定位情况。结果显示,legumain转录本为母系表达,在胚胎发育早期泛在性表达。在受精18h后在造血组织有特异的高丰度表达。双色原位杂交显示,legumain和泛髓系细胞、巨噬细胞、中性粒细胞有共定位表达。结果提示legumain在斑马鱼发育过程中有重要作用,在巨噬细胞中高表达并参与相关生理功能的完成。     

牦牛FHL2基因的克隆、组织表达与蛋白定位分析

旨在获得牦牛FHL2基因序列,阐明该基因序列、蛋白质结构与性质、mRNA的组织表达模式、在雌性生殖器官及颗粒细胞的蛋白表达特性。本研究以5头健康空怀成年母牦牛的心、肝、脾、肺、肾、卵巢、子宫、输卵管组织及5头妊娠2个月左右母牦牛的子宫、输卵管和卵巢为研究材料,利用逆转录PCR(RT-PCR)技术克隆FHL2基因,并使用在线分子生物学软件分析其生物信息学特性;利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析FHL2基因的组织表达特性;应用免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)技术检测FHL2蛋白在雌性生殖器官的分布和颗粒细胞上的亚细胞定位。结果发现,FHL2基因CDS区全长840 bp (ON456866),编码279个氨基酸,FHL2蛋白属于弱碱性亲水不稳定蛋白,没有跨膜结构。不同物种的FHL2氨基酸序列比对和进化树分析表明,FHL2基因编码区在物种进化中比较保守。RT-qPCR结果显示,FHL2基因在检测的组织都有表达,在心的表达量极显著高于其他检测组织(P<0.01);在肺、卵巢、输卵管和子宫中的表达量极显著高于肝、脾和肾(P<0.01)。FHL2基因在妊娠期子宫中的表达...     

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因核苷酸序列分析

从家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因 (ptp) ,该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,其中A为 16 3、C为 99、G为 113、T为 132 ,G +C含量约为 4 2 %。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由 16 8个氨基酸残基组成 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的 11个氨基酸“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)ptp和BmNPV T3株 (日本 )的ptp核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 %。BmNPV ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶 (BmNPV ZJPTPase)的氨基酸全序列与AcMNPV、BmNPV T3、芹菜夜蛾核型多角体病毒 (AfMNPV)PTPase和黄杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)PTPase 1的氨基酸全序列的同源性分别为 97%、97 6 %、96 %和 6 0 % ,而与OpMNPVPTPase 2的同源性仅为 2 0 %。在NCBI数据库中查找BmNPV ZJPTPase的同源性序列 ,查找到的 5 99381个序列中发现至少有 14种mRNA加帽酶其N端部分存在PTPase催化活性区的“HC”基序 ,但其氨基酸全序列的同源性只有 31%～ 32 %。该基因序列已被GenBank数据库收录 ,登录号为AF316 871     

猪瘟病毒E2基因在昆虫细胞中的分泌表达及活性检测

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）E0和E2囊膜糖蛋白是CSFV主要保护性抗原蛋白，均能诱导机体产生CSFV的中和抗体，保护机体免受强毒的攻击。尤其是E2糖蛋白，既是人们研究CSFV新型疫苗的主要对象，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，同时还是研究CSFV抗原变异的主要区域。鉴于E2基因在CSFV感染、复制和免疫方面的重要作用，因此一直是猪瘟病毒研究的热点。     

秦川牛CAP2基因CDS区克隆及表达谱分析

[目的]克隆秦川牛CAP2基因的编码区序列（CDS）,分析该基因在不同组织及原代脂肪细胞分化过程中的表达特征。[方法]采用RT-PCR方法扩增秦川牛CAP2基因的CDS区,运用ProtPram、TMpred、ProtFun 2.1 Server等在线网站进行CAP2蛋白的生物信息学分析;通过油红O染色和qPCR检测成脂标志基因PPARγ和FABP4基因的表达水平以构建牛原代脂肪细胞诱导分化体系;利用qPCR检测分析CAP2基因在秦川牛7种组织（心、肝、脾、肺、肾、肌肉和背脂）和原代脂肪细胞分化过程（0~10 d）中的表达。[结果]秦川牛CAP2基因CDS区长1 461 bp,编码486 个氨基酸,氨基酸序列主要由无规卷曲和α-螺旋构成。CAP2基因在脂肪组织中高表达,极显著（P<0.01）高于其他组织。牛原代脂肪细胞诱导分化过程中,PPARγ和FABP4基因的表达量逐渐上升,与第0天相比第10 天时表达量达到最大（P<0.01）;与对照组相比,诱导分化组脂滴积累明显增加;CAP2基因表达量也随时间推移逐渐上升,以0 d为对照,第10天表达量最高（P<0.001）。[结论]成功克隆了秦川牛CAP2基因全长1 461 bp的编码区;CAP2基因在牛脂肪组织中以较高水平表达,且CAP2基因可能参与脂肪生成与分化过程,预测CAP2基因可能是促进成脂分化的转录因子,对维持牛脂肪细胞状态发挥关键作用,可能作为秦川牛肉质性状的候选基因,该研究结果为进一步揭示牛CAP2基因的功能提供基础资料。     

秦川牛Snail2基因扩增、序列特征及表达特性分析

试验旨在扩增秦川牛Snail2基因,构建Snail2基因在其各组织不同发育阶段及脂肪细胞不同分化时期的时空表达规律,为进一步研究Snail2基因在牛脂肪沉积中的功能及调控作用奠定基础。以秦川牛为研究对象,经PCR扩增得到Snail2基因CDS区序列,运用生物信息学软件对其功能结构进行预测,同时采用实时荧光定量PCR检测Snail2基因在新生牛和成年牛各组织及脂肪细胞成脂分化过程中的时空表达谱。结果显示,秦川牛Snail2基因编码序列全长为952 bp。不同物种系统进化树结果表明,牛Snail2蛋白在家牛、水牛、山羊、绵羊中高度保守。磷酸化位点分析发现,存在41个潜在磷酸化位点,其中周期蛋白依赖性激酶1（cyclin dependent kinase 1,CDK1）、CDK5、CKⅡ、CKⅠ等多个细胞周期相关激酶参与了Snail2蛋白的磷酸化修饰。蛋白结构域预测发现,牛、人和鼠等8个物种中有8个相似Motif。Snail2蛋白二级结构主要由不规则卷曲构成,二、三级结构预测结果一致。Snail2基因启动子区序列分析发现1个CpG岛及E2F、C/EBPα（CCAAT/enhancer binding proteins alpha）、AP2和Sp1等与脂肪生成相关的转录因子结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Snail2基因在牛脂肪组织中呈现较高表达水平,且随着脂肪细胞成脂分化和牛生长发育过程均呈现上升趋势,表明Snail2基因在牛脂肪沉积过程中发挥重要作用。研究结果为进一步揭示Snail2基因通过影响脂肪细胞增殖和分化进而影响肉牛脂肪沉积作用机制奠定基础。     

组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内的表达

将组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。分别将这２种重组质粒直接注射于小鼠骨骼肌,观察了ｔ－ＰＡ基因在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验结果显示,注射重组质粒ＤＮＡ后,第５天凝血时间有所延长,第１５～２０天达到高峰,小鼠体外凝血时间平均延长７ｍｉｎ左右,延长时间与基因注射量呈明显的正相关。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析

研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。     

小鼠卵巢组织定量PCR分析中内参基因的筛选

旨在选择小鼠卵巢组织中合适的内参基因,为研究卵巢发育过程中基因表达提供可靠数据。以不同年龄(0日龄、3周龄、5周龄、8周龄)小鼠卵巢组织为试验材料,Trizol法提取样本总RNA,并合成cDNA,根据已报道的小鼠(Mus musculus)各组织中相对稳定表达的8个常见内参基因(Gapdh、β-actin、β-tubulin、18S rRNA、16S rRNA、H2afz、Ubc、Rpl13a)的GenBank登录序列设计引物,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法构建卵巢cDNA等梯度(1∶10)稀释后的标准曲线;利用geNorm分析候选内参基因的表达稳定性(M);NormFinder筛选表达最稳定的内参基因;BestKeeper计算qRT-PCR结果的标准差(SD)和变异系数(CV),从而预测候选内参基因的稳定性。结果表明,8个内参基因的引物特异性较强,具有良好的线性关系;候选内参基因的表达稳定度排序:Gapdh=β-actin>18S rRNA>Ubc>16S rRNA> H2afz>Rpl13a>β-tubulin;其中Gapdh表达稳定性最好,且标准差及方差系数最小(SD:0.32,CV:1.95),H2afz标准差及方差系数最大(SD>1.0,CV:5.76)。综上表明,本研究成功获得出生后小鼠卵巢发育过程中稳定表达的内参基因(Gapdh和β-actin),可作为其基因表达研究中的最佳候选内参。