狂犬病病毒糖蛋白跨膜区和膜内区的替换对其生物学特性的影响

为研究表达狂犬病病毒(RV)糖蛋白(G)重组新城疫病毒(r L-RVG)中RV G跨膜区(TM)及膜内区(CT)对RV G蛋白表达、病毒蚀斑的形成以及免疫原性的影响,本研究采用新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的TM和CT替换G蛋白的相应部分,构建出表达RV嵌合G蛋白(RVGTC)的重组NDV(r L-RVGTC)。激光共聚焦和western blot检测结果显示,r L-RVG和r L-RVGTC在BHK-21细胞中RVG表达量无显著差异;而且r L-RVG与r L-RVGTC在鸡胚中的病毒增殖滴度也无显著差异。但间接免疫荧光结果表明,r L-RVGTC在BHK-21细胞中丧失RV或r L-RVG形成病毒蚀斑的能力。并且以5×107半数鸡胚感染量(EID50)的r L-RVG和r L-RVGTC分别免疫小鼠后,r L-RVGTC诱导产生的RV中和抗体的滴度显著低于r L-RVG诱导的滴度。本实验结果显示TM和CT对RV G的病毒蚀斑形成及其免疫原性是必不可少的。     

重组杆状病毒表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的优化及蛋白免疫原性研究

为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示:2.0×10^6/mLHigh five细胞浓度、1.5MOI病毒感染量、蛋白表达时间168h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在High-five细胞中的表达条件优化、鉴定及免疫原性研究

为获得高蛋白含量和良好免疫原性的抗原,利用杆状病毒表达体系进行猪圆环病毒2型(PCV2)重组Cap蛋白表达,采取正交试验设计确定三因素(High five细胞浓度、病毒感染量、蛋白表达时间)的最佳组合,对重组病毒株vBac-SP-PCV2的表达条件进行优化,利用His Bind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,纯化蛋白作为标准蛋白用于Western blotting中蛋白质定量分析和蛋白免疫原性检测。结果显示：2.0×106/mL High five细胞浓度、1.5 MOI病毒感染量、蛋白表达时间168 h为重组PCV2-rCap蛋白表达的最佳条件,表达产物纯化良好,并能被PCV2多克隆抗体识别,免疫豚鼠可诱导产生高水平PCV2抗体。研究表明纯化PCV2-rCap蛋白可作为标准蛋白用于后续表达蛋白的定量分析和PCV2亚单位疫苗研发候选抗原。     

猪圆环病毒2型ORF2截短基因的原核表达与纯化

对重组原核表达载体pET-ORF2的表达条件进行优化,结果表明,最佳IPTG诱导浓度为1.0mmol/L,最佳诱导时间为5h。在最佳诱导条件下获得猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的基础上,利用HisBind蛋白质纯化试剂盒对表达产物进行纯化,再分别用SDS-PAGE电泳和Westernblotting对纯化产物的纯化效果及特异性进行检测,结果显示表达产物纯化良好,并能被PCV-2阳性血清识别,具有良好的抗原性。     

重组牛α-干扰素的原核表达与纯化

为在大肠杆菌表达系统中高效表达牛α-干扰素(bovine interferon-α,Bo IFN-α),将经密码子优化后的牛α-干扰素成熟蛋白基因合成并克隆到表达载体p Cold II中,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,获得可溶性的表达蛋白。对重组菌表达条件进行优化,结果显示在IPTG浓度为0.64 mmol/L,诱导温度为15℃,诱导时间为9 h的条件下,可溶性目的蛋白的表达量最高。重组蛋白经镍柱纯化后的纯度为99.2%,表达量为36 mg/L菌液。重组蛋白在MDBK细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1×106U/mg。     

狂犬病病毒G蛋白的克隆表达及其抗体胶体金检测试纸条的研制

狂犬病(Rabies)是一种由狂犬病病毒(RV)引起的急性人兽共患传染病,一旦发病,死亡率几乎为100％.为快速检测狂犬病病毒IgG抗体,本研究首先克隆表达并纯化狂犬病病毒G蛋白,应用G蛋白作为抗原,G蛋白单克隆抗体制备C线,鼠抗犬IgG和鼠抗猫IgG标记T线,经条件优化后,建立了一种能够用于快速检测动物狂犬病病毒血清...     

鸡传染性喉气管炎病毒gG蛋白间接竞争ELISA方法的建立及初步应用

鸡传染性喉气管炎是由鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)引起鸡的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。为建立检测该病毒g G蛋白的间接竞争ELISA方法，本研究以原核系统表达ILTV g G蛋白，并采用切胶纯化该重组g G蛋白(rg G)后经western blot检测纯化的rg G (P-rg G)与本研究室制备的g G蛋白单克隆抗体(MAb) 3C8的反应原性。将MAb 3C8采用Protein G亲和层析柱纯化后与HRP偶联(HRP-3C8)，利用间接ELISA法测定纯化HRP-3C8的效价。结果显示，P-rg G与MAb 3C8发生了特异性反应，在30 ku处出现特异性条带。纯化的HRP-3C8效价达1∶51 200。以P-rg G作为包被抗原，以纯化的HRP-3C8作为检测抗体，通过对各反应条件优化后初步建立了ILTV g G蛋白间接竞争ELISA (ic-ELISA)检测方法。条件优化结果显示，P-rg G包被量为12.5 ng/孔，HRP-3C8抗体稀释度为1∶10 000，将待检样品与HRP-3C8抗体在37℃孵育40 min后加入ELISA板再反应20 min,TMB底物反应...     

塞尼卡病毒VP1与VP3蛋白原核表达及蛋白纯化

利用原核表达系统表达塞尼卡病毒(Seneca Valley virus,SVV)VP1与VP3蛋白,优化其诱导表达条件,并进行蛋白纯化研究。扩增SVV VP1与VP3目的基因,并分别将VP1、VP3克隆至pET32a(+)载体,构建pET32a-VP1与pET32a-VP3重组质粒,将两者分别转化至BL21(DE3)大肠杆菌,经IPTG诱导表达。优化蛋白表达条件,利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋白。RT-PCR结果显示可扩增出792 bp SVV VP1与717 bp VP3目的片段,将VP1与VP3目的基因成功克隆至pET32a(+)载体,分别转化至BL21(DE3),成功地表达50 000 pET32a-VP1重组蛋白以及48 000 pET32a-VP3重组蛋白;pET32a-VP1及pET32a-VP3重组蛋白均在条件为37℃、0.6 mmol/L诱导剂诱导5 h表达量最高,重组蛋白均以包涵体的形式进行表达并且可纯化出目的蛋白。结果表明,本试验成功地利用原核表达系统表达并纯化SVV VP1与VP3重组蛋白,为制备单克隆与多克隆抗体、检测试剂盒研发以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

蛇毒类凝血酶基因在大肠埃希菌中诱导表达及影响因素

将蛇毒类凝血酶基因(TLE)亚克隆到原核表达载体pMAL-p2X上,对重组表达质粒鉴定正确后,转化大肠埃希菌BL21进行诱导表达;同时采用不同的OD值、诱导时间I、PTG浓度和诱导温度对尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶基因重组表达质粒pMAL-p2X进行了条件优化。研究发现,不同的诱导时间、IPTG诱导浓度和诱导温度与融合蛋白表达量有很大关系。SDS-PAGE结果显示,当OD值为0.5,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导温度为37℃时,诱导3 h后蛋白表达量最高,超出此范围可使表达量显著减少。在优化诱导条件后,融合蛋白的表达量可达全菌总蛋白量的66%。     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。     

羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。     

表达无毒性大肠杆菌ST1-LTB融合蛋白基因工程菌株的构建

利用基因突变技术，将形成ST1分子内二硫键的半胱氨酸碱基进行突变，使ST1失去本身毒性，进而将其与含有LTB基因的pET-28b( )连接，转化至受体菌BL21(DE3)，重组菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)经IPTG诱导后，其表达产物免疫的小鼠能够抵抗大肠杆菌强毒菌的攻击并且消除了ST1的毒性，表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXST3LTB)可作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选菌株。     

家蝇溶菌酶1基因的克隆、序列分析及原核表达

采用cDNA末端快速扩增技术（RACE）,对鸡致病性大肠杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库（SSH）中筛选得到家蝇溶菌酶1基因（（Musca domestica lysozyme-1,MdL-1）进行扩增,测序分析得到一个全长为537bp的cDNA片段,其开放阅读框（ORF）432bp,与Genbank中登录号为AY344589．1基因同源性为96％。构建重组表达质粒pET-32a-MdL-1,转化大肠杆菌BL21（DE3）,异丙基-β—D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析显示。表达产物大小约为34kD,与预期蛋白大小一致。结果表明,利用RACE技术克隆得到MdL-1全长基因并在大肠杆菌中获得了表达,为进一步研究该蛋白的生物学及免疫学活性奠定了基础。     

荚膜红细菌DSM1710中硫化物醌还原酶基因的克隆、表达及活性分析

为获得有活性的硫化物醌还原酶(sulfide-quinone reductase,SQR)并研究其功能,试验利用常规PCR方法从荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)中克隆了SQR基因全长CDS区1284 bp;成功构建了SQR基因的原核表达载体pRSETA-SQR,并转入大肠杆菌中进行诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,SQR融合蛋白成功表达,在37 ℃条件下,0.4 mmoL/L IPTG诱导表达6 h,50 ku的SQR融合蛋白表达量最高。可溶性分析结果表明,SQR重组蛋白以包涵体形式存在,经过纯化、复性后得到较高纯度的SQR活性蛋白。蛋白活性分析结果表明,该酶具有明显的消化底物decyl-UQ的能力,测定其酶活Km值约为4。     

家兔BMP7基因的原核表达及其适宜表达条件探索

为实现家兔BMP7基因原核表达及探索适宜的表达条件,采用PCR技术从pMD18-T-BMP7重组质粒中扩增获得BMP7基因成熟肽片段(mBMP7),构建原核表达工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS,并比较温度、IPTG浓度、诱导时间等因素对目的蛋白表达的影响。结果表明,mBMP7原核表达载体构建正确;工程菌pET32a-mBMP7/BL21(DE3)和pET32a-mBMP7/BL21(DE3)pLysS经IPTG诱导均可表达含有家兔BMP7成熟肽的34KDa的融合蛋白,表达产物约占菌体总蛋白的30%。在37℃、0.75 mM IPTG以及诱导150 min时,能取得较高的目的蛋白表达量;在20℃低温条件下,IPTG浓度和诱导表达时间应分别以0.20 mM和7 h为宜;另外,目的蛋白表达对工程菌生长无明显的不利影响。因此,成功地构建了家兔BMP7基因工程菌,并确定了适宜的表达条件,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

CPA-LTB融合基因的构建与表达

利用PCR技术，从A型产气英膜梭菌染色体和pEWD299中分别扩增出a毒素（CPA）基因和LTB基因，通过分离、纯化、内切酶酶切、连接和转化，构建了含CPA—LTB融合基因表达质粒的重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）。经酶切鉴定和核苷酸序列测定证实，构建的重组质粒pET—CPA含有CPA—LTB融合基因，其基因序列和阅读框架均正确。经EISA检测和SDS—PAGE分析，重组菌株表达的CPA—LTB融合蛋白能够被α、LT毒素抗体所识别。重组菌株BL21（DE3）（pCPA—LTB）经IPTG诱导后，融合蛋白CPA—LTB的表达量占菌体总蛋白相对含量的12.5％。     

噬菌体Bp7尾丝蛋白gp37的原核表达与鉴定

为了研究噬菌体尾丝蛋白gp37在识别宿主菌大肠埃希菌K12过程中的作用,PCR扩增获得gp37基因C端1 161bp序列,以EGFP为荧光标签,构建重组表达质粒pET-28a-EGFP-gp37,在大肠埃希菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达重组蛋白EGFP-gp37,亲和层析纯化蛋白。SDS-PAGE及Western blot检测结果表明,重组蛋白EGFP-gp37在大肠埃希菌BL21(DE3)为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白量的23%。EGFP-gp37融合蛋白与大肠埃希菌K12相互作用,激光共聚焦显微镜检测结果显示,尾丝蛋白gp37能够吸附到宿主菌K12表面,表明尾丝蛋白gp37参与宿主菌受体的识别和吸附过程。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21的原核表达及鉴定

本研究旨在克隆微小隐孢子虫黏附相关蛋白基因CP21开放阅读框,构建其原核表达质粒,并对获得的融合蛋白进行鉴定。从含CP21基因的噬菌体中提取模板DNA,PCR扩增基因片段,构建pET-28a-CP21原核表达质粒,转化至埃希氏大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。用原核表达蛋白免疫小鼠,制备抗重组蛋白多抗,对蛋白进行定位。结果表明成功扩增出CP21基因,并构建原核表达质粒,转化至大肠杆菌中表达出相对分子质量为25 ku的融合蛋白,Western blotting证明表达的CP21融合蛋白能与抗C.parvum多克隆抗体产生特异性反应。免疫荧光结果表明:CP21基因在子孢子和卵囊期均表达,且表达产物位于子孢子表膜和卵囊壁表面。CP21是一种与侵入机制有关的黏附相关蛋白。研究结果为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白gD主要抗原表位区基因的克隆及原核表达

本试验通过PCR方法以猪伪狂犬病病毒SD株的基因组DNA为模板扩增得到了含gD主要抗原表位编码区的片段,将该PCR产物克隆到pGEM-T载体上,酶切后插入原核表达载体pET-32a的T7启动子下游。构建的重组质粒pET-gD经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量约为45.2 ku,主要以包涵体形式存在。表达产物用His亲和层析柱纯化。Western blotting结果显示,该纯化蛋白能与猪伪狂犬病病毒抗体阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有良好的抗原反应性,可以作为猪血清伪狂犬病病毒抗体诊断用抗原。