小鼠2-细胞胚胎细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验在室温 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,利用不同浓度的玻璃化溶液 (EFS和EDFS) ,对小鼠 2 细胞胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻保存。在 2 0℃室温条件下 ,用EFS4 0平衡 1min细管一步法冷冻 ,解冻后囊胚发育率仅为35 .0 % ,和新鲜 2 细胞体外培养的对照组 (6 5 .0 % )的差异极显著 (P <0 .0 1)。当 2 细胞胚胎在 10 %EG +10 %D溶液中预处理 5min ,再移入EDFS中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后囊胚发育率达 4 7.8%～ 4 8.8% ;当室温升至2 5℃时 ,二步法冷冻保存后 2 细胞的囊胚发育率达到 5 2 .2 % ,与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )。改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的 2 细胞胚胎的囊胚发育率高达 6 2 .2 % ,为试验中的最佳组。用最佳细管法和OPS法冷冻组解冻后培养至囊胚移植给受体母鼠均获得产仔     

不同发育阶段圭山山羊胚胎常规冷冻保存研究

采用常规冷冻法冷冻保存圭山山羊桑椹胚、囊胚、扩张囊胚期胚胎,解冻后体外发育率分别为41.94%、67.50%、84.09%,桑椹胚与囊胚、扩张囊胚间差异显著(P<0.05),囊胚和扩张囊胚间虽无显著性差异(P>0.05),但扩张囊胚体外发育率高于囊胚.在胚胎的冷冻-解冻过程中,桑椹胚、囊胚、扩张囊胚的透明带受损伤率分别为6.45%、20.00%、31.82%,透明带受损的桑椹胚、囊胚、扩张囊胚体外发育率分别为0%、50.00%、78.57%.初步说明发育程度越高的胚胎,在冷冻-解冻过程中其透明带越易受到损伤,但随发育程度的加深,胚胎生长发育时对透明带的依赖程度也变得越来越弱,表明圭山山羊早期扩张囊胚最适宜进行冷冻保存.     

山羊胚胎冷冻保存技术研究

本研究探讨了不同抗冻保护剂、不同冷冻方法、玻璃化液(EFS40)中添加FCS和BSA,以及冷冻前细胞松驰素B处理对山羊胚胎冷冻保存效果的影响。结果表明,山羊胚胎常规冷冻时以1.5 mol/L EG为抗冻保护剂的保护效果最好,解冻后胚胎发育率为70.59%,孵化率为58.82%;玻璃化冷冻细管法和OPS法以EFS40为保护液的冷冻效果较好,其解冻后胚胎的发育率分别为67.57%和52.94%;EFS40中添加BSA的冷冻保护效果显著地高于不添加其他成分的EFS40;山羊胚胎冷冻前用细胞松驰素B处理,能提高冷冻保存的效果。     

影响山羊胚胎冷冻效果因素的研究

分别用浓度为1.5 mol/L的乙二醇(EG),1.5 mol/L 1,2-丙二醇(PROH)和1.5 mol/L甘油为冷冻保护液对山羊胚胎进行常规冷冻保存,结果三者对山羊胚胎的冷冻保护效果无显著差异,其中以1.5 mol/L EG的冷冻保护效果为佳。以EFS40为玻璃化液对山羊胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻,其结果与常规冷冻间差异不显著,表明常规冷冻法、玻璃化细管法和OPS法均可用于山羊胚胎的冷冻保存。采用25℃和37℃水浴对常规冷冻和玻璃化冷冻后的山羊胚胎进行解冻,从解冻后的发育效果看,二者间无显著差异,但37℃水浴解冻后的胚胎发育效果略好于25℃。还比较了玻璃化液EFS40中添加FCS和BSA后与不添加其他成分的EFS40对胚胎冷冻保护效果的影响,结果表明添加BSA的EFS40的冷冻保护效果显著地高于不添加其他成分的EFS40,但与添加FCS的EFS40间不存在统计学上的差异。     

绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)     

小鼠4-细胞胚胎OPS法冷冻保存技术

在25℃室温和37℃恒温台条件下，利用玻璃化冷冻溶液EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40，对小鼠4-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存．以解冻后培养72h的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标，同时对解冻后培养1～3h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。开放式拉长塑料细管（OPS）二步法冷冻保存，即胚胎首先移入预处理液（10％EG或10％EG＋10％DMSO）中平衡30s，再移入玻璃化溶液中洗涤后吸入OPS管中，分别经35、30或25s后直接投入液氮中冷冻保存。一步法冷冻保存则无需预处理液处理。结果表明，小鼠胚胎4-细胞一步法和二步法冷冻后囊胚最高发育率分别为87．7％和88.6％，与对照组（93.0％）差异不显著（P〉0．05）。利用最佳冷冻组获得的143枚胚胎移植于12只假妊娠50～60h的受体母鼠，结果有4只妊娠产仔17只，妊娠产仔率为42．5％（17／40），与对照组59．4％（19／32）差并不显著（P〉0.05）。     

乙二醇及二甲基亚砜对小鼠卵母细胞冷冻后纺锤体及孤雌激活后发育能力的影响

试验采用EFS30、DFS30和EDFS30冷冻液对小鼠MⅡ期卵母细胞进行玻璃化冷冻,并对冷冻-解冻后卵母细胞存活率、纺锤体形态正常率、孤雌激活胚胎的发育能力进行研究。结果表明:利用EDFS30冷冻-解冻卵母细胞后的存活率(98.3%)显著高于EFS30组(88.2%)和DFS30组(89.5%)(P0.05);DFS30组纺锤体形态正常率(44.9%)显著低于其他各组;而孤雌激活后EFS30、DFS30、EDFS30和对照组之间卵裂率(59.1%、56.3%、59.3%和60.0%)、囊胚率(52.0%、53.7%、61.2%和62.1%)和囊胚细胞数(49、48、50、50)均无显著性差异(P0.05)。综上所述,3种冷冻液冷冻卵母细胞孤雌激活后均可获得较好的体外发育能力,其中EDFS30较适宜小鼠MⅡ期卵母细胞冷冻保存。     

澳洲波尔山羊胚胎3种冷冻方法对其胚胎移植效果的影响

在25℃室温下,采用细管法(一步法、二步法)和OPS法,以不同浓度的EFS、EDFS为玻璃化冷冻液,对澳洲波尔山羊致密桑椹胚和囊胚进行玻璃化冷冻保存。同时利用1.5mol/LEG为抗冻保护剂对胚胎进行常规法冷冻保存。分别将上述3种方法冷冻解冻后的胚胎移植于同期发情后6~7d的云南黑山羊受体。结果表明,细管法胚胎玻璃化冷冻保存效果均以EFS40组为佳,解冻后胚胎移植产羔率分别为40.54%(15/37;一步法)和51.35%(19/37;二步法)。与新鲜胚胎移植产羔率(52.50%,21/40)和常规法冷冻保存的胚胎移植产羔率(45.16%,14/31)相比无显著性差异(P>0.05)。另外,用EDFS30玻璃化溶液,OPS法冷冻解冻后的胚胎移植产羔率高达51.43%(18/35),为整个玻璃化冷冻试验的最佳值。玻璃化冷冻方法简便、迅速,无论是细管法还是OPS法均获得了比较理想的胚胎移植效果。     

小鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法 ,将小鼠宰杀在 2 0℃下搁置 14 h,然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子 ,与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示 ,与带有颗粒细胞卵的体外受精率(0 % )和透明带切开卵的体外受精率 (4%～ 31% )相比 ,去透明带卵的体外受精率增至 39%～ 6 8% (P<0 .0 1) ;体外受精所获的 2细胞胚 ,经培养有 74 %～ 10 0 %的胚胎发育至扩张囊胚 ;来自 BDF1雄性小鼠精子的 2细胞期体外受精胚 ,经体外培养至囊胚期后再移植 ,获得了正常新生小鼠。以上结果表明 ,去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精 ,可提高小鼠弱精子的利用率     

封闭式拉长细管冷冻牛卵母细胞的研究

为探索封闭式拉长细管(closed pulled straw,CPS)冷冻牛卵母细胞的效果,将牛卵母细胞分别采用细管、开放式拉长细管(open pulledstraw,OPS)和CPS 3种方法进行冷冻,解冻后进行体外成熟、体外受精和胚胎体外培养。采用CPS法分别对GV期和成熟(MII期)牛卵母细胞进行冷冻保存,解冻后将卵母细胞培养至成熟,进行体外受精和胚胎体外培养。结果显示:OPS组和CPS组卵母细胞的正常形态率分别为83.1%和77.8%,成熟率分别为66.9%和64.4%,卵裂率分别为45.8%和43.4%,囊胚率分别为6.6%和6.0%,组间上述指标差异均不显著(P>0.05);但OPS和CPS组上述4项指标均显著高于细管冷冻组(P<0.05)。解冻后GV期和MII期卵母细胞卵裂率分别为44.5%和57.3%,囊胚率分别为6.8%和17.9%,组间卵裂率和囊胚率差异均显著(P<0.05)。结果表明:CPS法既具有OPS法快速降温的优点,同时,还能避免卵母细胞和液氮直接接触,降低卵母细胞通过液氮被污染的风险。因此,CPS冷冻法可以用于牛卵母细胞的冷冻。     

体外受精冻胚移植产五犊

从屠宰场采得牛卵母细胞,将其中卵丘细胞完好的进行体外成熟、体外受精处理后培养。在30天的试验期中,共试验了2297个卵母细胞,结果92%成熟、83%受精、73%发育分裂、48%发育至桑葚期、14%发育至膨胀囊胚期。另外还冷冻了300个不同胚龄的胚胎,在液氮中保存1年后解冻了98个,放在TCM-199液中培养4小时或2天,结果培养4小时的效果不及培养2天的。40个培养2天的胚胎,67%从早期囊胚发育成膨胀囊胚,46%从桑葚期发育至膨胀囊胚期,而16-细胞期的仅8%。冷冻-解冻后共同培养的胚胎移植后的妊娠率:培养2天的为50%,培养4     

不同冷冻和解冻方法对小鼠桑椹胚发育的影响

本试验以2种程序化冷冻液和2种玻璃化冷冻液对昆明白系小鼠的桑椹胚进行细管法冷冻保存,比较程序化冷冻-管外解冻和玻璃化冷冻-管内解冻对胚胎体内、外发育的影响。胚胎体外培养结果表明:玻璃化冷冻组及程序化冷冻组胚胎发育率(95.3%￣95.8%,98.9%)无显著(P>0.05)差异。将程序化冷冻、EFS30玻璃化冷冻以及新鲜的胚胎各168枚移植给假孕受体鼠,妊娠受体产活仔率各组间相比(50.8%,58.3%,54.9%)无显著性(P>0.05)差异。结果证明,玻璃化冷冻保存的胚胎管内解冻效果好,为生产中家畜的胚胎移植提供了理论和技术参考。     

猪冷冻（—20℃）胚胎在我国移植成功

实验Ⅰ将129枚猪胚胎,用于冷冻-解冻-体外培养研究。以含有1.5M甘油的PBS液为冷冻液,以1℃/分的速率从35℃降至-7℃,在-7℃自动诱发给冰,然后以0.3℃/分的速率降至-35℃,再以0.1℃/分的速率降至-36℃,立即投入液氮(-196℃);胚胎解冻在37℃水浴中进行、分步脱出甘油后以改进的mBMOC-Ⅱ为培养液进行体外培养。结果,囊胚、扩张囊胚、刚孵出囊胚和孵化出后期囊胚、解冻后体外培养存活率分别为0％(0 /2)、64％(16/25)、0％(0/9)。在液氮中(-196℃)保存80～103天,扩张囊胚、刚孵出囊胚和孵出后期囊胚解冻后,体外培养存活率分别为41.6％(5/12)、63.7％(7/11)和0％(0/70)。结果表明,在液氮温度(-196℃)保存下,刚孵出囊胚有较高的耐冻性和存活能力。实验Ⅱ进行猪冷冻胚胎解冻后体内发育能力研究。96枚扩张囊胚和刚孵出囊胚,分批冷冻和保存在-20℃、-35℃和-196℃。解冻后移植3头受体,其中2头返情,1头妊娠并于1990年7月31日产仔2头,公母各1头,初生重均为1.35kg,妊娠期为116夭。该结果为我国首例猪冷冻(-20℃)胚胎移植成功,并为今后开展猪胚胎超低温(-196℃)冷冻保存技术研究奠定了基础。     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

猪孤雌激活4-细胞胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

本实验旨在研究猪孤雌激活4-细胞胚胎的冷冻保存效果。胚胎采用Cryotop法进行玻璃化冷冻保存,解冻后分析其存活率、胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)水平、囊胚发育率及囊胚质量。结果表明:冷冻胚胎体外恢复2 h的存活率与新鲜胚胎无明显差异(100%vs.96.8%,P0.05),但当其培养时间达到24 h时,存活率显著下降至88.3%(P0.05)。另外,玻璃化冷冻导致胚胎内ROS水平显著升高(P0.05),GSH水平显著下降(P0.05)。与新鲜胚胎相比,冷冻胚胎获得的囊胚发育率明显降低(59.8%vs.26.4%,P0.05),但囊胚的凋亡细胞率、内细胞团数、滋养层细胞数及总细胞数均无明显差异(P0.05)。结果显示,玻璃化冷冻猪孤雌激活4-细胞胚胎导致其存活、氧化还原能力和囊胚发育下降,但仍能获得较高质量的囊胚。     

以乙二醇为基础的玻璃化溶液对小鼠扩张囊胚的超低温保存

在家畜胚胎发育中，扩张囊胚是一个非常重要的阶段。其中在牛羊方面第一例成功的胚胎冷冻即是在这个阶段完成的。同时人们已发现在猪囊胚扩张后、胚胎的抗冻力也上升。近年来．通过体外成熟、受精和发育的方法来生产牛的扩张囊胚。然而牛胚胎不论是用各种玻璃化冷冻法还是传统的冷冻方法．效果一直不佳。在超低温冷冻保存的小鼠囊胚的发育率比８细胞胚胎直到桑椹胚阶段的胚胎都低。本研究的目的是利用乙二醇为主的玻璃化溶液探索小鼠扩张囊胚冷冻所需的最适条件。１材料和方法１，１扩张囊胚的收集将６～１２周龄的雌性ＩＣＲ小鼠饲养在明暗…     

鼠去透明带裸卵的体外受精及其胚胎发育

为了建立提高小鼠弱精子体外受精率的新方法，将小鼠宰杀在20℃下搁置14h，然后取出附睾尾精子进行冷冻保存。用解冻后活力明显下降的精子，与去透明带裸卵进行体外受精。结果显示，与带有颗粒细胞卵的体外受精率（0％） 透明带切开卵的体外受精率（4％－31％）相比，去透明带卵的体外受精率增至39％－68％（P＜0．01）；体外受精所 2细胞胚，经培养有74％－100％的胚胎发育至扩经囊胚；来自BDF1雄性小鼠精子的2细胞期体外受精胚，经体外培养至囊胚期后再移植，获得了正常新生小鼠，以上结果表明，去透明带裸卵与小鼠弱精子体外受精，可提高小鼠弱精子的利用率。     

短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用

为研究短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用,对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎解冻后进行短期(2～4 h)培养,然后使用20%的低渗PBS液于25℃条件下处理20 min,观察48 h发育率、囊胚率和移植后妊娠率、产仔率.获得93%的48 h发育率和48%的囊胚率,显著高于低渗处理前未培养组(47%和9%)(P＜0.05).证明解冻后的短期培养中可以有效修复玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的损伤.     

奶牛体外受精胚胎的不同培养方法对比试验

以屠宰场奶牛卵巢为试验材料,研究体外、体内培养法对体外受精胚胎发育的影响。(1)体外受精胚胎在体外培养体系是否加输卵管上皮细胞单层(颗粒细胞单层)(2×106个/mL)的培养液中培养与临时受体绵羊体内培养对比试验。结果显示:在培养的第8天囊胚发育率无显著差异,体外培养体系囊胚形成主要集中在第8天(受精日为第0天)。体内培养体系囊胚的形成多数在第7天。加体细胞的体外培养体系与体内培养法囊胚生成率无显著差异,但却显著好于不加体细胞的简单体外培养法。(2)进行两种方法生产胚胎的程序冷冻、解冻敏感性试验。结果显示:体内培养法和普通体外法生产的胚胎解冻后存活率(90%、60%)和囊胚孵化率(85.7%、44.4%)存在极显著差异(P<0.01)。     

添加植物抗冻蛋白提高猪胚胎冷冻保存成活率的初步试验

本试验采集7天猪扩张囊胚和孵化后囊胚,在1.5M甘油冷冻液中添加二种浓度(0.5mg/ml,5mg/ml)植物抗冻蛋白(AFGPs),用慢速降温方法冷冻。猪胚胎冷冻-解冻后,体外培养12小时,发育率分别为25％(1/4)和80％(4/5);24小时发育率分别为0％(0/4)和40％(2/5),孵化囊胚率分别为0％(0/5)和20％(1/5),而对照组冷冻-解冻后培养发育率12小时和24小时均为0％(0/4)。试验表明,在冷冻液中添加一定浓度的植物抗冻蛋白,可提高猪胚胎冷冻-解冻后的成活率。