鸡胚盲肠上皮细胞原代培养与鉴定

为研究鸡E.tenella的宿主细胞--盲肠上皮细胞体外培养技术,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型,分别用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、嗜热菌蛋白酶法、嗜热菌蛋白酶+胶原酶Ⅰ法和中性蛋白酶Ⅰ+胶原酶Ⅺ法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定细胞活力、细胞团块比例、总细胞产量和细胞团块产量,筛选出鸡胚盲肠上皮细胞最佳分离方法,并进行了纯化和培养,对培养细胞进行了鉴定.结果表明:嗜热菌蛋白酶消化、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,为最佳分离和纯化盲肠上皮细胞的方法;分离纯化的细胞接种后分别于第3-5天、第10-11天进入对数生长期,可存活14 d以上;经形态学观察、碱性磷酸酶染色、扫描电镜鉴定为盲肠上皮细胞,所分离的细胞培养至第4、7、11天时上皮细胞比例分别为81.67%、84.33%和72.00%.用该法可获得纯度较高的原代鸡胚盲肠上皮细胞.     

鸡肠上皮细胞原代培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮细胞体外分离培养方法,进一步研究鸡源志贺菌Ipa C毒力蛋白在鸡肠上皮细胞上的受体蛋白分子,试验分别无菌取14,16,18日龄鸡胚肠组织,用300 U/m LⅪ型胶原酶和0.1 mg/m LⅠ型中性蛋白酶混合搅拌消化25 min,用壁差法纯化鸡肠上皮细胞,贴壁时间差为3 h,分别种植于20%FBS包被过的和未包被过的一次性塑料细胞培养瓶中,在倒置显微镜下观察细胞生长状态,透射电镜下对培养细胞进行鉴定。结果表明:采用16日龄鸡胚肠组织用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶联合消化25 min,可获得较多的肠隐窝单位,肠上皮细胞在20%FBS包被过的一次性细胞培养瓶中贴壁效果良好,细胞生长状态良好;透射电镜下可见鸡肠上皮细胞的微绒毛,鉴定为鸡肠上皮细胞。     

鹅小肠上皮细胞的分离培养研究

取29～30胚龄的鹅胚为试验材料,通过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养,采用刮除法、相差消化及相差贴壁法对上皮细胞进行纯化,用0.05%Trypsin-EDTA进行消化传代,通过形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定.结果表明:组织块种植法得到的鹅小肠上皮细胞生长状况良好,细胞活性较强,经过纯化,得到了纯度较高的鹅小肠上皮细胞.而联合使用浓度为300 U/mL的胶原酶(Ⅺ型)和0.1 mg/mL的中性蛋白酶(Ⅰ型)、多次(短时间)消化收获细胞法虽然可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位,但传代后其增殖能力明显下降;形态学观察及免疫细胞化学法鉴定为阳性,证明分离出的细胞为小肠上皮细胞,从而为小肠上皮细胞的进一步研究奠定了基础.     

鸡胚小肠上皮细胞的分离及原代培养研究

<正>取18日龄的SPF鸡胚,分别采用组织块培养法、胰蛋白酶、胶原酶I和嗜热菌蛋白酶消化法分离和体外培养小肠上皮细胞。结果表明:组织块培养法所获得的上皮细胞纯度较低;胰蛋白酶消化后多为单细胞,细胞贴壁和生长能力较弱;胶原酶Ⅰ单独消化50min或嗜热菌蛋白酶单独消化110min以及胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶联     

不同浓度表皮生长因子(EGF)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响

为了研究不同浓度表皮生长因子(EGF)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响,通过体外培养鸡胚盲肠上皮细胞,添加不同浓度表皮生长因子(EGF,0、10、20、30、40 ng/mL)对鸡胚盲肠上皮细胞生长的影响,并对体外培养的鸡胚盲肠上皮细胞进行了碱性磷酸酶鉴定,细胞形态学观察贴壁率,测定生长曲线。结果显示:加入20 ng/mL的EGF,对鸡胚盲肠上皮细胞增殖的促进作用是极显著的(P0.01)。表明EGF作为重要的细胞因子之一,参与调节并促进鸡胚盲肠上皮细胞体外生长。     

鸡胚盲肠上皮细胞的传代培养

本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定.结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞.用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠EEC为阳性,即为小肠上皮细胞.     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定。结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞。用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠IEC为阳性,即为小肠上皮细胞。     

鸡小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

选择组织块法分离培养鸡小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC),采用机械刮除法和相差消化－相差贴壁法纯化细胞,0.05%的Trypsin-EDTA对获得的IEC进行消化传代,免疫细胞化学法鉴定IEC。结果表明,组织块培养法可分离出活性较强的IEC,并获得纯化的上皮细胞;形态学和免疫细胞化学法检测显示获得的细胞表面抗原呈阳性,鉴定为IEC;纯化的IEC可在体外稳定传代。     

鸡肠上皮细胞原代培养方法的改进研究

鸡肠上皮细胞(Intestinal epithelial cell,IEC)既是消化吸收的功能性细胞又是肠道免疫的天然屏障,本研究旨在探讨IEC的分离方法和改进其体外培养条件.试验选取20日龄鸡胚,分离肠组织后利用刮取法获得了肠绒毛及隐窝单位,在体外与成纤维细胞共同培养最终获得了活性较高的肠上皮细胞.对所分离细胞进行形态学观察和生化指标的检测,鉴定为IEC.结果表明,共培养方法可以使体外IEC的培养时间延长,可有效满足实验需要,为长时间培养IEC提供了新的方法.     

Effect of dipeptide on intestinal peptide transporter 1 gene expression: An evaluation using primary cultured chicken intestinal epithelial cells

Peptide transporter 1 (PepT1) is a transporter responsible for absorbing dipeptide and tripeptide in enterocytes and is upregulated by dipeptide in mammals. It has not been certain whether intestinal PepT1 expression is responsive to dipeptides in chickens because of the lack of in vitro study using the cultured enterocytes. This study established a primary culture model of chicken intestinal epithelial cells (IECs) in two-dimensional monolayer culture using collagen gel by which the response of chicken PepT1 gene expression to dipeptide stimuli was evaluated. The cultured chicken IECs showed the epithelial-like morphology attached in a patch-manner and exhibited positive expression of cytokeratin and epithelial cadherin, specific marker proteins of epithelial cells. Moreover, the chicken IECs exhibited the gene expression of intestinal cell type-specific marker, villin1, mucin 2, and chromogranin A, suggesting that the cultured IECs were composed of enterocytes as well as goblet and enteroendocrine cells. PepT1 gene expression was significantly upregulated by synthetic dipeptide, glycyl-l-glutamine, in the cultured IECs. From the results, we herein suggested that dipeptide is a factor upregulating PepT1 gene expression in chicken IECs.     

A newly established bovine intestinal epithelial cell line is effective for in vitro screening of potential antiviral immunobiotic microorganisms for cattle

We evaluated whether a bovine intestinal epithelial (BIE) cell line could serve as a useful in vitro model system for studying antiviral immune responses in bovine intestinal epithelial cells (IECs) and for the primary screening of immunobiotic microorganisms with antiviral protective capabilities. Immunofluorescent analyses revealed that toll-like receptor 3 (TLR3) was expressed in BIE cells, and the results of real-time quantitative PCR showed that these cells respond to stimulation with poly(I:C) by up-regulating pro-inflammatory cytokines and type I interferons. In addition, we demonstrated that BIE cells are useful for the primary screening of immunobiotic lactic acid bacteria strains which are able to beneficially modulate antiviral immune responses triggered by TLR3 activation in bovine IECs. The characterization of BIE cells performed in the present study represents an important step towards the establishment of a valuable bovine in vitro system that could be used for the development of immunomodulatory feed for bovine hosts.     

鼠李糖乳酸杆菌LG_A对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响

本研究旨在研究益生性鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞β-防御素-9 (AvBD9)表达的调节作用.选用鼠李糖乳酸杆菌LGA对体外培养的鸡小肠上皮细胞进行剂量依赖性及时间依赖性刺激实验,利用实时荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)从mRNA水平研究刺激后上皮细胞AvBD9基因表达水平的差异.结果表明,不同浓度(2×105、2×106、2×107 cfu· mL-1)鼠李糖乳酸杆菌LGA均能上调AvBD9mRNA的表达,且在不同细菌浓度之间AvBD9 mRNA的表达存在差异.热灭活鼠李糖乳杆菌LGA亦能上调AvBD9基因表达,且上调值显著高于活菌(P＜0.05).鼠李糖乳杆菌LGA刺激上皮细胞后AvBD9表达存在时间依赖关系,12 h时AvBD9的表达达到峰值.Western blot检测结果显示,鼠李糖乳杆菌LGA刺激后的上皮细胞培养上清中存在AvBD9蛋白表达,表明AvBD9蛋白可以分泌到细胞外而发挥其生物学功能.益生性鼠李糖乳酸杆菌LGA与鸡肠道上皮细胞的相互作用过程中,鼠李糖乳酸杆菌LGA能够促进上皮细胞抗菌肽β-防御素-9的表达.本研究结果提示益生性乳杆菌可能通过促进肠道上皮抗菌肽的表达而发挥其益生作用.     

发酵乳酸杆菌F6对鸡小肠上皮细胞β-防御素-9基因表达的影响

采用实时荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR）检测益生性发酵乳酸杆菌F6刺激鸡小肠上皮细胞后抗菌肽β-防御素-9（AvBD9）基因表达变化,为从益生菌与上皮细胞抗菌肽表达关系的新角度解析益生菌发挥益生作用的新途径和机制提供一定的基础及依据。利用不同剂量（2×105,2×106,2×107 CFU）的发酵乳酸杆菌F6分别刺激原代培养的鸡小肠上皮细胞4h,提取刺激后的细胞总RNA,反转录为cDNA,FQ-PCR检测抗菌肽AvBD9基因表达变化。结果表明,未受刺激的正常对照组也检测到AvBD9mRNA的表达,发酵乳酸杆菌F6能上调AvBD9基因表达。刺激组中AvBD9mRNA的表达在不同剂量组之间存在差异。2×105 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量极显著高于未受细菌刺激的对照组和2×106 CFU/mL组（P〈0.01）,显著高于2×107 CFU/mL组（P〈0.05）。2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组AvBD9mRNA的表达量显著高于未受细菌刺激的对照组（P〈0.05）,但2×106 CFU/mL组和2×107 CFU/mL组之间无显著差异（P〉0.05）。发酵乳杆菌F6与鸡小肠上皮细胞相互作用过程中可提高抗菌肽AvBD9mRNA的表达,且存在剂量依赖性。     

Differential expression of Toll-like receptor mRNA in White Leghorn and indigenous chicken of India

In the present experiment, the expression profile of Toll-like receptor mRNA in indigenous and pure line chickens was studied. The expression of TLR3, TLR4, TLR5 and TLR7 were quantified in heterophils of Aseel, Kadaknath, Naked neck, Dwarf and White Leghorn lines by Quantitative Real-time PCR. White Leghorns expressed significantly (P < 0.01) higher levels of TLR3 mRNA compared to other lines. TLR4 and TLR5 mRNA were significantly highly expressed in Kadaknath line. Among the TLRs investigated TLR5 was more expressed in all lines studied. TLR7 was highly expressed in indigenous chicken Aseel and Kadaknath than other lines. Dwarf chicken expressed significantly (P < 0.01) lower levels of all TLRs investigated. On the basis of the present study we conclude that the differential expression of TLR mRNA in the heterophils of indigenous and other chicken breeds might contribute to their variable disease resistance/susceptibility.     

猪TLR5基因表达水平与F18大肠杆菌侵染关系分析

为了探究猪Toll样受体（Toll-like receptor 5,TLR5） 基因表达水平与F18大肠杆菌抗性的关系,试验通过不同血清型产肠毒素大肠杆菌（F18ab和F18ac）侵染猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）,同时通过脂多糖（LPS）分别诱导IPEC-J2细胞4和8 h,利用实时荧光定量PCR检测TLR5基因表达水平变化,并利用Western blotting进行蛋白表达分析。结果显示,不同血清型大肠杆菌（F18ab和F18ac）菌体侵染IPEC-J2细胞后,TLR5基因表达水平均极显著上调（P<0.01）;LPS诱导IPEC-J2细胞4和8 h后,TLR5基因表达水平均极显著上调（P<0.01）,且在LPS诱导IPEC-J2细胞8 h后,TLR5基因表达水平明显高于诱导4 h。与对照组相比,细胞中TLR5蛋白的表达水平极显著上调（P<0.01）,与LPS诱导及F18大肠杆菌菌体刺激IPEC-J2细胞后mRNA表达水平结果相一致。本研究在细胞水平上分析了TLR5表达水平和F18大肠杆菌侵染的相关性,进一步证实猪TLR5基因的表达水平在细胞抵抗F18大肠杆菌的侵染过程中发挥了重要的调控作用,为今后关于TLR5基因功能及其在大肠杆菌腹泻遗传育种应用的研究奠定基础。     

轮状病毒感染肠上皮细胞激活宿主先天免疫研究进展

轮状病毒(RV)是引起婴幼儿、幼畜禽急性肠胃炎的人畜共患病原,常与其他病原体混合感染,多以呕吐,严重水样腹泻,脱水为临床症状,感染后具有较高病死率,对人类公共卫生以及养殖业造成极大危害.RV病原相关分子模式(PAMP)可被肠上皮细胞(IECs)中一组可遗传的模式识别受体(PRR)识别,通过IECs、先天免疫细胞与RV互...