甘蓝BoPID基因的克隆与分析

在通过酵母双杂交文库获得了与钙响应蛋白BoSPx相互作用蛋白BoPID的基础上,对BoPID的编码基因进行了克隆、时空特异性表达分析及筛选与其互作的蛋白,以期为BoSPx通过BoPID参与自交不亲和性分子过程提供依据.结果表明,BoPID包含2个外显子和1个内含子,编码439个氨基酸.激酶磷酸化预测分析显示具有激酶活性...     

甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1 蛋白基因的克隆与表达分析

 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受 自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为 3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码 363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix（bHLH）功能域,在SCR、SRK、 Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box（CANNTG）序列。 在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR 检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1 基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化 分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。     

甘蓝自交不亲和性相关基因BoPLL的克隆、定位与表达分析

对高度自交不亲和甘蓝柱头进行自花授粉和异花授粉处理后,取柱头进行蛋白质表达谱的比较研究,获得一种受自花授粉诱导下调表达,异花授粉诱导上调表达的蛋白,命名为BoPLL。进一步分析转录组数据发现,BoPLL在自花授粉0 ~ 30 min上调表达,30 ~ 60 min下调表达,而在异花授粉0 ~ 60 min一直上调表达。克隆获得cDNA为1 212 bp,编码含403个氨基酸残基的蛋白质BoPLL。序列分析发现BoPLL含有高度保守的PASTA结构域和CMM-10结构域、中度保守的PbH1结构域、低度保守的HYDRO结构域,说明该蛋白是典型的PLL家族蛋白。染色体定位结果表明,该基因与自交不亲和性相关基因不连锁。进化分析表明,甘蓝BoPLL与拟南芥AtPLL亲缘关系最近,与苜蓿MtPLL亲缘关系较远。RT-PCR发现,BoPLL在甘蓝花粉和柱头中表达,且柱头中的表达量明显低于花粉,在叶片、花蕾、萼片和花瓣中均没有检测到表达信号。荧光定量PCR结果显示,BoPLL在自花授粉和异花授粉15 ~ 60 min的表达变化趋势与转录组分析结果基本一致。根据上述结果推测BoPLL可能是一种参与甘蓝自交不亲和反应过程的基因。     

结球甘蓝花粉钙调素基因的克隆与表达分析

 根据芸薹属植物钙调素基因保守区域设计引物,采用同源克隆的方法从结球甘蓝自交不亲和系和自交系花粉中克隆得到一个钙调素开放阅读框cDNA 序列,该序列长450 bp,编码149 个氨基酸;编码蛋白不含跨膜区,无信号肽,具有4 个完整的EF-hand 结构域。构建了结球甘蓝花粉钙调素原核表达系统,钙调素基因及其3 个突变体在E. coli 中得到表达,均获得分子量约为16 kD 的可溶性融合蛋白,在EGTA 存在的条件下,各融合蛋白具有各自独特的凝胶迁移现象,活性检测表明甘蓝花粉钙调素活性依赖于钙离子。该基因在甘蓝自交不亲和系花粉萌发过程中表达量先上升后下降,在自交系中随花粉萌发增大而降低;在含有钙调素拮抗剂TFP 的培养基中,自交不亲和系和自交系花粉中钙调素基因表达量均受到抑制;在含有W-7 琼脂糖的培养基中无明显差异。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

甘蓝OguCMS相关的花药优势表达转录因子BoBHLH1的克隆与表达分析

以甘蓝OguCMS花药中下调表达的EST序列为信息探针,克隆到一个与甘蓝OguCMS相关的bHLH家族转录因子,命名为BoBHLH1（GenBank登录号：GU390530）,该基因编码102个氨基酸,具有典型的bHLH结构域,可识别顺式元件G-box序列,预测该蛋白定位在线粒体上。荧光定量RT-PCR表明,BoBHLH1是一个甘蓝花药中优势表达的基因,且在花药发育的早期和晚期均有一个表达高峰。研究结果为下一步分析其在甘蓝花药发育过程中的功能验证及OguCMS核质互作机理奠定了基础。     

番木瓜开花相关基因CpFT1及启动子的克隆与表达分析

以番木瓜（Carica papaya L.）花为材料,利用番木瓜基因组序列设计番木瓜CpFT1和启动子扩增引物,通过PCR获得了该基因长度为525 bp的基因组DNA序列和1 500 bp的上游调控序列。通过生物信息学分析,发现CpFT1编码174个氨基酸。经序列对比及进化分析发现,番木瓜FT基因与山毛榉FT基因同源性最高。亚细胞定位显示CpFT1蛋白定位于细胞核。进一步分析CpFT1的启动子序列,脱落酸、赤霉素、水杨酸等激素调控相关的元件位于CpFT1上游1 500 bp的序列上。利用实时荧光定量PCR检测了CpFT1在不同性别花器官、花不同发育阶段以及不同激素处理下花中的表达差异,结果表明CpFT1的表达可能受到脱落酸、水杨酸等激素的调控。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

唐菖蒲茉莉素受体基因GhCOI1的克隆与表达分析

通过RACE技术在唐菖蒲(Gladiolus hybridus)品种‘Rose Supreme’的籽球苗叶片中克隆得到茉莉素受体COI1基因的c DNA序列,命名为Gh COI1。该基因全长为2 603 bp,包含一个编码613个氨基酸的开放阅读框,5′utr和3′utr分别为484 bp和277 bp,预测的蛋白质分子量为69.46 k D;其氨基酸序列具有典型的F-box基序和LRRs结构域。同源比对和系统进化树的分析结果表明,Gh COI1与番茄Le COI1氨基酸序列的相似性最高,达到64.3%;与水稻Os COI1的亲缘关系最近。利用实时荧光定量PCR分析基因表达的结果表明,Gh COI1在唐菖蒲叶片中的相对表达量最高,根中其次,匍匐茎、新球、籽球、花瓣、雄蕊、雌蕊里中的相对表达量较低,推测在唐菖蒲中存在器官专一性表达的COI1同源基因。采用0.05、0.1和0.5 mmol·L-1 Me JA喷施处理唐菖蒲叶片,检测到施用0.1 mmol·L-1 Me JA可显著上调Gh COI1的表达。同时伴随此浓度Me JA处理时间的增加,12 h内Gh COI1的表达量呈现先上升再下降后上升的趋势。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明Gh COI1蛋白定位于细胞质和质体中。本研究中初步验证了Gh COI1在茉莉素信号途径中的作用。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

据《园艺学报》2014年第2期《草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析》（作者张勇等）报道，以“丰香”草莓为试材进行基因克隆，并通过SON—PCR结合RT—PCR技术检测了该基因在低温胁迫和其他环境胁迫下的诱导表达特性。     

甘蓝自交不亲和信号传导中SRK 结合蛋白基因THL1 的克隆与序列分析

 采用PCR 和RT-PCR 技术, 从甘蓝基因组和柱头总RNA 中扩增获得了719 bp 的硫氧还蛋白(THL1) 的全长基因序列和430 bp 的cDNA 序列。序列分析首次表明, 克隆的THL1 基因全序列有两个内含子, cDNA 序列编码117 个氨基酸。     

结球甘蓝叶片卷曲过程中6个生长素相关基因的克隆与表达分析

生长素在结球甘蓝球叶向上、向内自然卷曲的过程中发挥着重要的调控作用。为挖掘重要的影响结球甘蓝叶片卷曲的生长素相关基因,通过对结球甘蓝莲座期叶片与结球期叶片的转录组进行对比分析,筛选出6个显著差异表达的生长素相关基因,分别为调控生长素动态平衡的Bo ILL6、Bo ASA1基因,控制极性运输的Bo SF21、Bo PIN4基因,参与信号转导的Bo ARF8、Bo GH3.5基因。对上述6个基因进行同源克隆,分别获得全长c DNA序列,序列分析发现6个基因均含有生长素相关的结构域。分子进化树分析发现各基因与芜菁的对应基因遗传关系最近,拟南芥次之。荧光定量PCR检测结果显示,Bo ILL6、Bo ASA1与Bo SF21的表达量变化最为显著,结球期叶片相对莲座期叶片的表达量差异均高达12倍以上,变化趋势与转录组数据分析结果基本一致,说明这3个基因可能与结球甘蓝叶片的卷曲发育密切相关。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

羽衣甘蓝中一个突变型肉桂酸- 4 - 羟化酶基因的克隆及分析

 以羽衣甘蓝为材料, 克隆了全长2 431 bp的肉桂酸- 4 - 羟化酶基因BoC4H。它有两个内含子, mRNA为1 715 bp, 编码一个481个氨基酸的推导蛋白, 与其它植物C4H有广泛同源性。它含有细胞色素P450保守域和特征基序, 如血红素结合域、E - R - R三联体、含T的结合槽基序、酶正确定向必需的铰链基序。BoC4H具有C4H /CYP73A5的大部分特征性底物结合位点基序( SRSs) 和酶活性位点残基,但与拟南芥等植物C4H相比其编码区3′发生了C₂₂₄₂单碱基缺失和相应移码, 导致其蛋白C - 末端缺失/变异了36个残基, SRS6基序和其上的活性位点残基也相应缺失, 因此BoC4H可能无功能或活性低。BoC4H为膜蛋白, 可能定位于内质网, 其二级结构主要为α - 螺旋和随机卷曲。Swiss-Model不能预测出其三级结构。甘蓝中存在一个至少由5个成员构成的C4H基因家族。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

甘蓝幼苗期叶片生理指标的变化

研究了3个不同熟期甘蓝品种幼苗期叶片蛋白质含量、可溶性糖舍量、还原糖含量和叶绿素含量的变化.试验结果表明,3种甘蓝幼苗期蛋白质舍量和叶绿素含量总体上都呈上升的趋势.可溶性糖含量都表现为在幼苗期的前3周逐渐升高并在第3周达到最高值,在第4周显著降低后又逐渐升高.还原糖含量多呈现无规律的波动性变化,但是还原糖含量的值都显著低于可溶性糖含量.     

甘蓝类蔬菜亲缘关系的RAPD初步分析

利用RAPD标记从DNA水平上对30份甘蓝类蔬菜材料进行亲缘关系和遗传多样性分析,从100对引物中选出10对扩增效果较好的引物,用其扩增出90条带,其中多态条带72条,多态率为80.0 %。对RAPD结果进行UPGMA分析,结果表明,在相似系数0.85处可以清楚的将它们划分为6组,并且从分子生物学的角度分析了它们之间的亲缘关系。     

自交不亲和甘蓝亲和花粉授粉早期差异蛋白质分析

 为从蛋白质的角度揭示自交不亲和甘蓝亲和授粉早期花粉与柱头相互作用,将蛋白质组学方法应用于自交不亲和性甘蓝柱头与亲和花粉互作早期差异蛋白质的研究。结果表明,亲和授粉后3 ~ 5 min与1 h对比,有116个差异蛋白质点,而授粉后1 h与2 h差异不显著。按照特异表达与变化量大的蛋白质点优先原则,初步选取差异点中71个点做质谱分析,鉴定出31个可信差异蛋白质。与亲和授粉后3 ~ 5 min组相比,1 h组中特异表达蛋白质有19个,上调表达9个,下调表达3个。31种蛋白质的生物信息学分析表明,有两种蛋白与前人发现的与花粉管在柱头中生长发育相关蛋白相同,其他29种参与包括胁迫与防御应答在内多种生理过程。对早期差异蛋白中这种“既有促进花粉管发育的蛋白,也有与防御相关蛋白”现象分析表明,花粉管生长性侵入柱头的过程有可能伴随着柱头抗性的提高。