广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析

本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性,为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。本研究于2019—2020年,从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。用PCR方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测,通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究,利用斑马鱼模型进行了致病性试验。结果显示：从261份病样中分离到35株无乳链球菌;血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ia型;主要毒力基因的检测证明,cylE、sodA、gapC基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100%,而scpB只在人源参考菌株中检出;药敏试验结果发现,无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90%以上,对6种抗菌药耐药率为50%以上,分离株的耐药基因型和表型部分一致,无乳链球菌分离株均多重耐药,其中5重及以上耐药的菌株为27株,占总菌株数的77.1%;斑马鱼致病试验表明,无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性,为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。     

罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定

从南宁市某淡水罗非鱼养殖场的濒死罗非鱼分离获得7株优势菌株,经人工腹腔注射感染罗非鱼,仅发现菌株LFY-5注射后的罗非鱼出现与自然发病罗非鱼相似的症状,死亡率高达60％。经检测,LFY-5菌株为链状或成对排列的革兰氏阳性球菌,单个球形菌体直径为1．0～1．2jxm,在血琼脂培养基上呈13一溶血;对阳性克隆进行DNA检测得到长度为1510bp的16SrRNA基因片段,即分离菌株为无乳链球菌（S．agalactiae）。药敏试验结果显示,菌株LFY-5对头孢氨苄、万古霉素、头孢唑啉、头孢哌酮、新生霉素等18种药物高度敏感,但对菌必治、复达欣、替卡西林、头孢噻肟等8种药物不敏感。     

罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及药敏试验

从广东省佛山市2个水产养殖场患病罗非鱼中分离到2株细菌,分别编号为T4SH和G6C,经形态学、培养特性观察、生化鉴定和16S rDNA基因序列分析证实为无乳链球菌。2株分离菌株均为革兰阳性菌,呈β溶血;16S rDNA基因序列与无乳链球菌同源性达99%以上。2株菌均对青霉素类、头孢类、林可胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类抗生素敏感,对氨基糖苷类不敏感;而对磺胺类、喹诺酮类的敏感性存在差异。     

无乳链球菌致病因子的研究进展

无乳链球菌是人和动物的主要致病菌之一,该菌可引起人和动物的脑膜炎、肺炎、败血症等疾病。目前已发现的无乳链球菌主要致病因子包括荚膜多糖、溶血素、透明质酸酶、环磷酸腺苷(CAMP)因子、超氧化物歧化酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶等。作者就上述几类致病因子进行综述,介绍了近年来国内外无乳链球菌的致病性及致病机理等方面的一些研究进展。     

柳州地区罗非鱼无乳链球菌与海豚链球菌分离株药敏性分析

为了解柳州地区罗非鱼链球菌的耐药性情况,本研究对从柳州地区分离得到无乳链球菌和海豚链球菌分离株进行药敏试验。结果显示,无乳链球菌与海豚链球菌之间的药敏结果有较大差异,而同一种细菌的不同菌株对药物的敏感性却较为一致。总体来说,两种菌对青霉素、头孢类药物均具有很高的敏感性,对喹诺酮类药物敏感性不高;无乳链球菌对多粘菌素B、复方新诺明、卡那霉素、磺胺异噁唑4种药物完全耐药,但海豚链球菌却对这些药物呈现不同程度的敏感性。     

水温对吉富罗非鱼人工注射无乳链球菌部分生物学指标的影响

为揭示高温条件与吉富罗非鱼对无乳链球菌的抵抗力的关系,观察了不同温度对吉富罗非鱼部分生物学指标(超氧化物歧化酶,溶菌酶,碱性磷酸酶和补体C3)的影响。结果显示,在高温(34℃)条件下,吉富罗非鱼超氧化物歧化酶活性呈现先诱导后抑制的趋势;碱性磷酸酶活性在12h达到最高,显著高于31℃感染组B2(P0.05),在感染链球菌后24、36h,34℃条件下的B3组罗非鱼血清溶菌酶活力分别显著低于对照组B2(P0.05)25.88%和28.75%;感染后12、36h,补体C3活性分别显著低于对照组A3(P0.05)53.22%和36.19%。结果表明,高温降低了吉富罗非鱼的抵抗力,使鱼体对病原菌易感性增强。     

无乳链球菌特性及毒力相关因子研究进展

乳腺炎是造成奶牛淘汰,给牧场带来较大经济损失的一种常见疾病。无乳链球菌是引发该病的主要病原体之一,可引起奶牛较高的乳腺炎发病率。因此了解无乳链球菌生物学性状及毒力作用机制十分重要。本文对无乳链球菌的特性和对奶牛养殖业的危害进行了介绍,对无乳链球菌的血清型和基因型进行了阐述,对无乳链球菌的黏附因子、侵袭因子和免疫逃避因子等毒力因子的作用机制进行了探讨。期望通过以上概述能够促进无乳链球菌的防治工作,降低奶牛乳腺炎发病率,促进奶牛养殖业健康发展。     

三黄连散对罗非鱼人工感染无乳链球菌的保护作用

试验选用高剂量(26.40 g/kg)、中剂量(13.20 g/kg)和低剂量(6.60 g/kg)的三黄连散饲喂人工感染无乳链球菌的罗非鱼,观察并记录其临床症状和死亡率,旨在明确三黄连散对罗非鱼人工感染无乳链球菌的预防作用。结果显示,高剂量和中剂量的三黄连散保护率分别为77.77%和55.55%,且与市售三黄散相比,效果较稳定。研究表明,三黄连散对罗非鱼无乳链球菌的预防作用较好。     

海南罗非鱼源无乳链球菌的分离鉴定及生物学特性研究

为探究目前海南地区罗非鱼无乳链球菌病的流行性,了解该地区无乳链球菌耐药情况,本研究2020年8月从海南地区部分渔业养殖场的病鱼中共分离获得15株无乳链球菌,对各分离菌株的血清型、主要毒力基因及耐药性进行检测,并对多重耐药情况进行分析。血清型检测结果显示,15株分离菌株的血清型与对照菌株A909一致,均为Ⅰa型。毒力基因检测结果显示,15株分离菌株均未检出毒力基因scpB,但该毒力基因在参考菌株人源无乳链球菌2603V/R中检出,而主要毒力基因cylE、sodA、gapC的检出率均为100%。药敏试验结果表明,15株分离菌株对甲氧胺嘧啶、磺胺异噁唑、复方新诺明、链霉素、新霉素、庆大霉素的耐药率达85%以上;对头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、卡那霉素、红霉素、利福平、克林霉素敏感性达80%以上;未发现对甲氧胺嘧啶、氟罗沙星、链霉素、新霉素、庆大霉素敏感的菌株。多重耐药检测结果表明,15株分离菌株均至少对4种药物表现耐药,其中6重及以上耐药的菌株占总分离菌株数的86.67%,并有2株为13重耐药菌株。本研究为海南地区鱼源无乳链球菌病的用药提供参考,为华南地区罗非鱼无乳链球菌的流行病学和疾病防控提供调查依据。     

三黄连合剂对罗非鱼人工感染无乳链球菌的预防作用

为了研究三黄连合剂对罗非鱼无乳链球菌病的预防作用,通过给罗非鱼投喂添加含中药复方提取物三黄连合剂的饲料,观察中药复方提取物对人工感染无乳链球菌罗非鱼保护作用,并以氟苯尼考作为抗生素药物对照。结果表明,给药组罗非鱼攻毒后死亡率明显小于感染不给药对照组。30 m L/kg、60 m L/kg、120 m L/kg三黄连合剂添加组、0.05 g/kg氟苯尼考添加组的罗非鱼死亡率分别为低于对照组的25(p0.05)、25(p0.05)、33.33(p0.01)和45.83(p0.01)个百分点;保护率分别为26.08%、34.78%、47.82%和26.08%。其中以120m L/kg添加剂量保护效果较好,30 m L/kg三黄连合剂保护效果与0.05 g/kg氟苯尼考相当。本试验结果说明,三黄连合剂对罗非鱼无乳链球菌病具有较好的预防效果。     

鱼类无乳链球菌病的研究进展

无乳链球菌是常见的人兽共患病原菌,常导致新生儿肺炎、脑膜炎、败血症及奶牛乳腺炎。近年来,在水生动物体内也频繁分离到该菌,尤其是自2007年以来,该菌每年都在中国广东、海南、福建、广西等罗非鱼主要养殖区暴发流行,严重威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。作者综述了当前国内外对鱼类无乳链球菌病的病原学、流行病学、症状、病理变化、毒力因子（荚膜多糖、CAMP因子、表面免疫原性蛋白、α蛋白、C5a肽酶）和防控等方面的研究进展,以期为中国鱼类无乳链球菌病的防控提供参考。     

Research Progress on Fish Streptococcus agalactiae Disease

Streptococcus agalactiae is common zoonotic bacteria,which cause neonatal pneumonia,meningitis,septicemia and mastitis in dairy cows.In recent years,it was also be isolated from aquatic animals frequently.Especially since 2007,diseases caused by the bacteria outbreak in Guangdong,Hainan,Fujian,Guangxi and other tilapia aquaculture areas and had a serious threat to the healthy development of tilapia aquaculture in china.In this paper, research progresses on fish Streptococcus agalactiae disease were reviewed.The etiology,epidemiology,symptoms,pathological changes,virulence factors (capsular polysaccharide,CAMP factor,Sip,protein alpha,C5a peptidase) and prevention and control were included in the review,which would provide references for the fish Streptococcus agalactiae disease prevention and control.     

广西罗非鱼无乳链球菌的分离鉴定、毒力基因及耐药性研究

本研究旨在明确中国罗非鱼主养区广西各地罗非鱼无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）分离株的血清型分布、毒力基因携带情况和耐药情况,为罗非鱼无乳链球菌病的防控奠定基础。2018-2019年从广西柳州、钦州、南宁、北海等地患无乳链球菌病罗非鱼体内分离了47株无乳链球菌,并对各分离株的血清型、毒力基因分布和耐药情况进行检测和分析。血清型检测结果表明,47株无乳链球菌血清型高度一致,均为Ⅰa血清型。对4种毒力基因检测结果表明,47株无乳链球菌临床分离株cylE、sodA、gapC毒力基因的检出率均为100%,而scpB基因仅在人源参考菌株2603V/R中检出,在所有鱼源分离株中未检出。对11类（31种）常见抗生素的药敏试验结果表明,临床分离株对磺胺异噁唑、新霉素、庆大霉素、卡那霉素的耐药率达到90%以上,对氧氟沙星、左氧氟沙星、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢克洛、头孢曲松、头孢哌酮、头孢拉定、土霉素、强力霉素的敏感性均为100%。多重耐药检测结果表明,5重以上耐药菌株占93.62%,其中9重以上耐药菌株为19.15%,且均分离自柳州地区。结果表明,广西地区罗非鱼源无乳链球菌血清型单一,均为Ⅰa血清型,且均携带多种毒力基因,多重耐药现象严重。     

罗非鱼无乳链球菌EsxA基因克隆与原核表达

Ⅶ型分泌系统(T7SS)是近年来发现的分泌系统,分泌两种胞外蛋白,EsxA基因编码的ESAT6蛋白和EsxB基因编码的CFP-10蛋白。分泌蛋白具有良好的免疫原性,促进细菌从巨噬细胞吞噬体逃逸、影响巨噬细胞凋亡及裂解细胞等生物学功能,与致病性密切相关。以罗非鱼源无乳链球菌为模板,克隆到294bp的EsxA基因,将目的序列克隆到pMD18-T载体,经测序,目的序列与无乳链球菌EsxA基因同源率在99%以上。EsxA基因克隆到pET32a载体中,重组载体在28℃、0.5mmol/L IPTG诱导条件下表达量最大,可溶性表达。将纯化的ESAT6蛋白免疫Balb/c鼠,成功制备ESAT6蛋白鼠多克隆抗体,经Western blot,ESAT6蛋白具有良好的反应原性。研究结果为进一步进行无乳链球菌ESAT6蛋白的免疫学功能研究奠定了基础。     

无乳链球菌检测及其奶牛乳腺炎防治的研究进展

本文就近年来国内外在无乳链球菌的鉴定、检测方法、防御等方面的研究进展进行了系统性的综述,为控制该病原微生物的传播、蔓延和由无乳链球菌引起的奶牛乳腺炎的防治提供参考。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）属于B群链球菌,是影响人畜健康的重要病原微生物之一。它可以引起新生儿脑膜炎、肺炎、败血病等,又是奶牛乳腺炎的主要病原体之一,给奶牛业造成了巨大的损失。     

无乳链球菌及其血清型的PCR方法鉴定

无乳链球菌(S.agalactiae)是引起奶牛乳房炎和新生儿期侵袭性感染(包括败血症、肺炎和脑膜炎)的重要病原菌.为快速准确地鉴定S.agalactiae及其血清型,本研究对22株从国内不同地区分离的牛源链球菌进行生化鉴定以及针对S.agalactiae保守基因sip进行PCR鉴定,并采用多重PCR技术扩增sip基因阳性菌株的cps基因进行血清分型.结果显示,PCR扩增sip基因阳性17株,其中15株生化试验与PCR结果一致;多重PCR扩增cps基因显示,其中Ia型4株、Ⅱ型11株、Ⅲ型2株.本研究为鉴定S.agalactiae及其血清型提供了参考.     

无乳链球菌dnaJ基因缺失株的构建及其致病性研究

为研究dnaJ基因序列与细菌致病力的关系,本研究构建了dnaJ基因缺失株和互补株,并对其致病性进行验证。参照GenBank中无乳链球菌GD201008-001（登录号：NC_018646）目的基因序列分别设计引物,PCR克隆dnaJ基因上、下游同源臂基因序列,通过融合PCR将两个片段连接到一起,构建dnaJ基因上、下游同源臂融合片段,PCR克隆含有启动子序列的dnaJ基因。将dnaJ基因上、下游同源臂融合片段和含有启动子序列的dnaJ基因分别连接链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s和pSET2,电转化GD201008-001感受态细胞,构建dnaJ基因缺失株ΔdnaJ和互补株CΔdnaJ。通过分析ΔdnaJ和CΔdnaJ的遗传稳定性与形态学变化对dnaJ上、下游基因转录的影响,以及生长速率和斑马鱼攻毒试验评价dnaJ基因对无乳链球菌毒力的影响。经PCR鉴定和测序证明,ΔdnaJ和CΔdnaJ构建成功;与野生株GD201008-001相比,ΔdnaJ和CΔdnaJ在细菌染色形态上均无明显差异,但ΔdnaJ在液体培养基中的生长速度明显减缓;dnaJ基因的缺失未对相邻基因的转录造成影响;ΔdnaJ对斑马鱼的毒力明显下降,对斑马鱼的LD₅₀为5.68×10⁴ CFU,约是野生株的241倍。dnaJ基因对无乳链球菌的毒力有显著影响,本试验结果为进一步探究无乳链球菌dnaJ基因的功能提供了参考依据。