Cloning and sequencing of encoding region of heme oxygenase-1 gene from Tibetan antelope

AIM: To clone and analyze the encoding region of heme oxygenase-1(HO-1) gene from Tibetan antelope(Pantholops hodgsonii). METHODS:The total RNA was isolated from the liver of Tibetan antelope and the HO-1 gene was amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned into pGEM-T vector and sequenced. The nucleotide sequences were compared with the data from GenBank by BLAST method. RESULTS:The encoding region of HO-1 gene from Tibetan antelope was obtained and deposited in GenBank as accession number JQ809687. The encoding sequence was 897 bp in full length, which encoded 298 amino acids. Sequence similarity analysis showed that the HO-1 gene cloned from Tibetan antelope shared 98% and 96% in the nucleotides, and shared 92% and 97% in the amino acids with those of Capra hircusand Bos taurus, respectively. The sequence similarity of nucleotides and amino acids also shared 86% and 87% with other vertebrates, which were highly conservative. The molecular phylogenetic tree based on the amino sequence of HO-1 showed that Tibetan antelope and Capra hircus was classified to one cluster, which was basically concerted to the evolutionary relationship of traditional species. CONCLUSION:The encoding region of Tibetan antelope HO-1 gene is successfully cloned, which provides a foundation for exploring the molecular and biological mechanisms of high altitude adaptation and cell protection in Qinghai-Tibet Plateau species under hypoxic condition.     

青花菜快速碱化因子RAL F 的克隆与序列分析

 以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段序列为信息探针, 在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索, 经人工拼接、RT - PCR克隆与序列分析验证, 获得了青花菜快速碱化因子RALF(Rapid Alkalinization Factors) 基因的cDNA全长序列, 命名为BoRALFL1 (GenBank序列登录号DQ059310)。该cDNA全长240 bp, 编码79个氨基酸, 与电子克隆获得的序列完全相同。序列分析表明, 编码蛋白存在前导信号肽与多个磷酸化位点, 与同源基因RALFL8核酸序列在88 bp上有82%的一致性, 推导的氨基酸序列在74个氨基酸上存在56%的一致性, 不同植物间氨基酸序列N - 端差异大, C - 端具有较高的保守性。     

茄子GA响应因子SmGAI的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术从茄子地方品种杭州红茄中扩增克隆了GA响应因子相关基因片段,命名为SmGAI,其cDNA序列为1 176 bp,含有972 bp的阅读框,编码323个氨基酸;基因编码的氨基酸序列与番茄单性结实调控基因SlDELLA同源性为76.8 %,高度相似。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

白菜β-1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜抗霜霉病品种‘雪克青’cDNA 为模板, 采用RT2PCR 技术, 获得了1032 bp 的β- 1,3- 葡聚糖酶基因的cDNA 序列。序列分析表明, 克隆的β- 1,3 - 葡聚糖酶基因cDNA 序列编码343 个氨基酸, 与芜菁bg1 基因具有98 %的同源性, 与拟南芥bg2 基因具有84%的同源性。在GenBank 中登录号为AY395720 。     

百合肌动蛋白基因lilyActin 的克隆与表达分析

 为了在百合功能基因表达研究中选择一个理想内参基因,依据岷江百合cDNA 文库所获得的百合肌动蛋白（Actin）基因的EST 序列,采用RACE 技术进行该基因cDNA 全长克隆,并利用实时荧光定量PCR 分析其在不同组织中的表达模式,获得百合肌动蛋白基因cDNA 全长序列（GenBank 登录号：JX826390）,命名为lilyActin。该基因cDNA 全长1 367 bp,其中,5′非编码区91 bp,3′非编码区233 bp,开放读码框1 134 bp,编码377 个氨基酸。序列比对发现,该基因与其它15 种植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性达98%。进化分析显示,百合肌动蛋白与郁金香肌动蛋白的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR 结果显示,该基因在百合的花蕾、叶片和鳞片组织中恒定表达,表明相对于其他物种的内参基因,lilyActin 更适宜作为百合属植物的内参基因。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

一个中国水仙MADS-box基因的克隆与分析

 采用RT-PCR技术从中国水仙（Narcissus tazetta var.chinensis）幼嫩花蕾中分离到一个新的水仙花发育相关MADS-box基因,命名为NTMADS1（GenBank登记号：EF421828）。该基因长879 bp,编码区共编码230个氨基酸,具有典型的植物MADS-box基因结构,由MADS区、I区、K区和C末端组成。序列分析结果表明,NTMADS1编码的蛋白与其它植物的MADS-box蛋白有着较高的一致性,其中与扫状天门冬（Asparagus virgatus）的AVAG1的一致性高达89％。系统进化树分析表明NTMADS1属于AG亚族。     

辣椒高赖氨酸蛋白基因Cflr全长cDNA的克隆及其组织表达特征

为了在茄科植物中寻找新的高赖氨酸蛋白基因,以辣椒栽培种‘江蔬7号'的成熟花粉为材料,根据马铃薯和番茄中高赖氨酸蛋白基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR技术扩增到一条长390 bp的cDNA片段,继而应用RACE技术克隆了一个辣椒高赖氨酸蛋白基因的全长cDNA,命名为Cflr（GenBank登录号：EU367999）。Cflr基因cDNA全长920 bp,5＇端有84 bp的非翻译区,3＇端具有完整的polyA尾,包含一个编码223个氨基酸的完整开放阅读框。Cflr基因与马铃薯和番茄高赖氨酸蛋白基因cDNA序列的同源性为50%～60%,氨基酸序列的同源性为40%～50%。该基因所编码的蛋白质中赖氨酸含量为21.2%,苏氨酸含量为10.3%,是目前已知赖氨酸含量最高的天然蛋白。半定量RT-PCR结果表明,Cflr基因在辣椒未成熟花药、成熟花粉、花瓣、茎、叶片和根中均有表达,在成熟花粉和花瓣中的表达丰度最高,在叶片中表达量明显减少,而在未成熟花药、茎和根中的表达量极少。     

白菜GLDH 基因cDNA的克隆及序列分析

 以白菜品种‘苏州青’ cDNA 为模板, 采用RT-PCR、巢式PCR、3’RACE和5’RACE技术, 获得了L - 半乳糖酸- 1, 4 - 内酯脱氢酶(EC 1.3.2.3, GLDH) 基因cDNA 2 034 bp全长序列。序列分析表明, GLDH基因cDNA序列编码601个氨基酸。其氨基酸序列与花椰菜GLDH基因具有98%的同源性, 与拟南芥GLDH基因具有90%的同源性。该基因在GenBank中登录号为AY899298。     

银耳α–微管蛋白基因的克隆及序列分析

 根据GenBank上已发表的其他真菌α–微管蛋白基因序列中的保守区域设计简并引物,扩增出银耳α–微管蛋白基因的cDNA部分序列。分别利用SEFA-PCR方法和RACE技术,克隆了银耳α–微管蛋白基因的DNA和cDNA全长序列。银耳α–微管蛋白基因DNA全长1 962 bp,含有9个内含子,cDNA全长1 347 bp,编码448个氨基酸。生物信息学分析结果表明：银耳α–微管蛋白基因的cDNA序列与新型隐球酵母有80%相似性,编码的蛋白质属于Tubulin_FtsZ超家族中的α–微管蛋白亚家族,氨基酸序列中存在保守的GTP结合区域GGGTGSG,系统发育树显示银耳与新型隐球酵母距离最近。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

桃成花基因PpLFY的克隆与表达及多克隆抗体制备

 以‘八月脆’桃成花诱导期腋芽为试材,克隆得到一个FLORICAULA/LEAFY同源基因,命名为PpLEAFY（PpLFY）,GenBank登录号为EF175869,该基因cDNA全长1 314 bp,ORF为1 248 bp,编码一个含416个氨基酸残基的蛋白,与其他物种中的LEAFY蛋白的同源性较高,为（74.22%~84.69%）。时期及组织特异性表达分析表明,PpLFY主要在叶片、花瓣及成花诱导期及花芽形态分化初期中表达。构建了pGEX-4T-1/PpLFY原核表达系统,获得了可溶性融合蛋白rPpLFY,分子量约为36 kD。利用该蛋白免疫新西兰大白兔,获得了抗rPpLFY的多克隆抗体,ELISA效价为1:10 000。     

中矮1号梨砧木(S_2)PGIP基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,根据GenBank中梨属PGIP基因序列设计1对特异引物,以梨矮化砧木S2叶片总RNA为模板,克隆到1条约1100bp的cDNA片段,将其与pMD18-Tvector连接后转化Escherichia coli JM109,对筛选到的阳性克隆进行序列测定并使用生物信息学方法对所得结果进行综合分析。结果表明,克隆片段为梨PGIP基因,该cDNA编码330个氨基酸,预测分子量为36388ku,第1～24个氨基酸残基是信号肽。与梨属其它种中已获得的PGIP核苷酸序列开放阅读框(Open reading frame,ORF)的同源性为97.5%～99.6%,氨基酸序列的同源性为97.6%～99.1%。     

香菇乳清酸核苷-5'-单磷酸脱羧酶编码基因le-pyrG的克隆

通过巢式简并PCR和基因组步行技术从香菇(Lentinula edodes)单核体中克隆到乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶(orotidine-5'-monophosphate decarboxylase,OMPDC)的编码基因le-pyrG,长度为946 bp.经生物信息学分析,香菇le-pyrG基因含有2个长度分别为67 bp和51 bp的内含子,该基因可以编码1个含有275个氨基酸残基的蛋白质序列,该序列经比对分析显示与裂褶菌(Schizophyllum commne)和灰盖鬼伞(Coprinus cinereus) OMPDC序列的相同性分别为73%和70%,相似性分别为84% 和83%.这是首次报道从栽培食用真菌中克隆出乳清酸核苷-5′-单磷酸脱羧酶编码基因的全序列.     

cDNA文库与RACE方法结合克隆马铃薯DnaJ -like基因全长cDNA

 以青枯病菌小种3号(生化变种2) PO41诱导24 h和48 h的马铃薯抗青枯病基因型ED13叶片为材料, 应用SMART技术构建了一个富集青枯病抗性相关基因的cDNA文库。继而利用RACE技术与该cDNA文库相结合克隆了一个马铃薯分子伴侣基因的全长cDNA。该cDNA长735 bp, 5′端有25 bp的非翻译区, 3′端具有完整的polyA 尾, 包含一个编码177 个氨基酸的完整开放阅读框架( GenBank 登录号:DQ885360) 。该分子伴侣基因与拟南芥DnaJ-like 20的部分核苷酸序列具有84%的一致性, 与其编码的氨基酸序列具有59%的一致性, 暂命名为StDnaJ。目前在马铃薯中尚未发现与之同源的已知基因。半定量RTPCR结果表明, 该基因同时受青枯病菌的诱导和茉莉酸的调节, 可能在青枯病菌和茉莉酸胁迫下具有促使胁迫损害细胞恢复活性的功能。     

甘蓝LFY基因的克隆及序列分析

以甘蓝ZQ启动抽薹的茎尖为材料,分别提取DNA和RNA,以两对引物扩增并序列拼接得到甘蓝LFYZQ基因DNA序列和cDNA完整编码区,长度分别为2 560、1 239 bp,与花椰菜、拟南芥、芥菜和萝卜同源性分别达到91 %、87 %、86 %、87 %。该基因含有3个外显子（452、394、393 bp）和2个内含子（514、807 bp）,共编码412个氨基酸,内含子剪接位点均符合经典GT-AG法则。将LFYZQ与网上公布的12种十字花科植物LFY氨基酸序列按分子进化分成两类：甘蓝LFYZQ与花椰菜以及Jonopsidium属植物Jonopsidium acaule这3个分为一类;其余10种植物分为第二大类。LFYZQ蛋白分子量为46 kD,是一个不稳定的疏水蛋白,存在N-十四（烷）酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、酰胺化位点共4种活性位点。     

荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究

 应用RT-PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长,命名为LcAP1（基因登录号：JN214349）。LcAP1基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子量为28.39 kD,等电点为9.69。序列分析显示,LcAP1基因编码的蛋白在1 ~ 61氨基酸含有1个MADS盒结构域,在89 ~ 179氨基酸有1个K盒结构域。蛋白质二级结构预测表明,LcAP1基因编码的蛋白有3个α螺旋,2个β折叠区,8个β转角。同源分析表明,LcAP1基因在不同植物中的一致性为72% ~ 82%。半定量RT-PCR分析表明,在‘三月红’荔枝花芽分化期,LcAP1基因在成熟叶、幼叶、老茎、嫩茎、花芽和花梗中均表达,在花芽中表达最多。     

一个辣椒肌醇半乳糖苷合成酶同源基因的全长cDNA克隆与低温表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从低温处理的辣椒(Capsicum annuum L.)品种“苏长红”叶片中克隆得到一个肌醇半乳糖苷合成酶同源基因（GS）的cDNA序列(GenBank登录号：EF566470), 其全长1 444 bp, 推断其编码336个氨基酸。序列分析表明该基因与其他高等植物的GS基因具有较高的同源性。利用RT-PCR技术分析辣椒受低温胁迫后该基因的表达情况,发现该基因常温下在辣椒各组织中均无表达,经4 ℃或10 ℃处理6 h后在叶片中开始表达,而茎和根系中无论低温处理与否均不表达。Southern杂交结果表明辣椒基因组中还存在其他GS同源基因。