带有绿色荧光蛋白外源DNA转染绵羊成纤维细胞的研究

为了优化建立转染绵羊成纤维细胞系的外源基因转染体系,本研究利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的外源基因,采用阳离子脂质体法,探讨了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊成纤维细胞的影响。结果表明,在500 μL转染培养基中成纤维细胞达到85%汇合时,添加由50 μL DMEM中含有0.2 μg DNA和50 μL DMEM中含有2.0 μL LipofectamineTM 2000的两种溶液混合构成的转染液并转染12 h,可获得最高的转染效率。当转染12 h后,用基础培养液培养至第24小时,细胞核周区出现强绿色荧光,而当转染后48～64 h观察时,细胞核周区的荧光强度明显弱,而远离核周区的胞质中的荧光强度增加。     

阳离子脂质体转染家蚕培养细胞的技术体系研究

阳离子脂质体转染家蚕培养细胞是家蚕基因功能研究的重要技术之一。利用阳离子脂质体Lipofectamine2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]转基因表达载体,对家蚕卵巢细胞BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21进行了外源DNA质量、脂质体用量、转染细胞密度和转染孵育时间等4个转染条件的优化实验,筛选到了阳离子脂质体转染效率最高的细胞系BmN-SWU1。BmN-SWU1细胞的最佳转染条件为:外源DNA0.6μg,脂质体2.5μL,细胞密度1×105mL-1,无血清条件下孵育24 h。此条件下转染效率可达55.08%。用抗生素G418筛选转染后的BmN-SWU1细胞,建立了GFP转基因细胞系。     

不同体细胞类型和基因转染方式对绵羊克隆胚胎体外发育的影响

首先获得绵羊胎儿成纤维细胞、成年耳组织成纤维细胞及前脂肪细胞,用脂质体介导法、BTX电转法及Nucleofector核转法对上述细胞系转染绿色荧光蛋白(gfp)基因,并对转染效率进行比较,最后探讨3种转gfp基因细胞对绵羊转基克隆胚发育的影响。结果:核转法的转基因效率最高,3种细胞的转基因效率分别为86%,87%和90%,显著高于BTX电转法和脂质体法基因转染效率;脂质体转染效率显著低于BTX电转效率(P<0.05)。而对同一种转染方法而言,基因转染效率在3种细胞间差异均不显著(P>0.05)。在以上述3种转基因细胞为核供体的转基因克隆试验中,胚胎融合率、卵裂率均无显著性差异(P>0.05),胎儿成纤维细胞组的囊胚率显著高于前脂肪细胞组(P<0.05),但耳组织成纤维细胞组与胎儿成纤维细胞、前脂肪细胞间差异均不显著(P>0.05)。结果表明核转法基因转染效率最高,胎儿成纤维细胞最适合于胚胎克隆研究。     

MSTN基因敲低绵羊成纤维细胞株的筛选

为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。     

脂质体法转染山羊骨骼肌特异细胞条件的优化

试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。     

重组绵羊pEGFP-PRNP质粒构建及真核细胞转染

构建了携带绵羊朊蛋白基因（PRNP）的重组真核转染质粒,通过脂质体转染试剂将其转染至神经胶质瘤细胞（C6）,以期为进一步研究绵羊朊蛋白的生理功能和从细胞水平研究朊蛋白疾病的发病机制奠定基础。采用PCR扩增目的基因序列,纯化后将其克隆到带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒pEGFP-PRNP做酶切鉴定。而后采用阳离子脂质体转染法将重组质粒转染到C6细胞,荧光显微镜观察。经鉴定,绵羊PRNP基因已克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,成功地构建了重组pEGFP-PRNP质粒,并可稳定地在C6细胞中表达。本研究为外源朊蛋白在细胞中表达提供了平台,为进一步在细胞水平研究朊病毒疾病奠定了基础。     

脂质体法转染水牛肾脏成纤维细胞条件的优化

试验旨在研究脂质体介导基因转染水牛肾脏成纤维细胞时如何获得较高的转染效率。本研究将以绿色荧光蛋白基因为标记基因,利用Lipofectamine LTX介导外源DNA转染水牛肾脏成纤维细胞,探讨脂质体用量、质粒用量、质粒大小、转染时间、细胞初始接种密度对转染效率的影响。结果表明,4 μg pmaxGFP质粒DNA与4 μL脂质体转染6 h,其细胞活性达98%,可获得较满意的转染效率。     

脂质体转染胚盘细胞制备携pEGFP—C2基因的转基因鹌鹑

利用脂质体转染第X期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP—C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋X期胚盘下腔,处理种蛋110枚,封口后孵化。出壳9只G0代,出壳率为8．18％。经检验6只鹌鹑中有4只为阳性,阳性率为66．67％。对成年的4只转基因鹌鹑中的1只内脏组织进行PCR分析以及切片荧光检测,证实外源基因在G0代成年鹌鹑组织中成功表达。将3只成年转基因鹌鹑分别与野生型鹌鹑进行杂交,得到G1代阳性率分别为33．96％、20．59％、10％。再将3只成年转基因公母鹌鹑之间进行杂交,得到G,代阳性率分别为10．87％、42．86％。证实利用脂质体转染胚盘细胞制备转基因鹌鹑是可以将外源基因整合到G0代生殖系中,且外源基因能遗传给后代。     

脂质体转染胚盘细胞制备携pEGFP-C2基因的转基因鹌鹑

利用脂质体转染第X期胚盘细胞的方法将外源质粒pEGFP-C2经脂质体包裹后注射到鹌鹑种蛋X期胚盘下腔,处理种蛋110枚,封口后孵化。出壳9只G0代,出壳率为8.18%。经检验6只鹌鹑中有4只为阳性,阳性率为66.67%。对成年的4只转基因鹌鹑中的1只内脏组织进行PCR分析以及切片荧光检测,证实外源基因在G0代成年鹌鹑组织中成功表达。将3只成年转基因鹌鹑分别与野生型鹌鹑进行杂交,得到G1代阳性率分别为33.96%、20.59%、10%。再将3只成年转基因公母鹌鹑之间进行杂交,得到G1代阳性率分别为10.87%、42.86%。证实利用脂质体转染胚盘细胞制备转基因鹌鹑是可以将外源基因整合到G0代生殖系中,且外源基因能遗传给后代。     

山羊体细胞转基因方法的探讨

转基因体细胞核移植是制备高效表达转基因动物的主要手段与方法,但由于插入位点、拷贝数不同常使外源基因的表达受到一定影响。本试验以双正向选择标记的pLoxP M为转基因结构,以磷酸钙法、脂质体介导法、电击转染三种方法对山羊胎儿成纤维细胞进行转染。电击(1 70×10-4)和脂质体(1 36×10-4)法明显高于磷酸氢钙法(4 6×10-5),而且三方法的转染效率与细胞类型无关,但电击转染方法简单并适合于不同大小的转基因结构,对长片段更为实用。随机整合的转基因细胞系绿色荧光蛋白的表达水平有很大差异,主要与外源基因的拷贝数和插入位点有关。双正向选择标记不但可以筛选重组体而且可以体外监控外源基因的表达情况,为高表达转基因动物的制备提供了良好的手段与方法。     

蒙古羊羊水源干细胞分离培养及其成骨分化研究

试验旨在建立羊水源干细胞系并对其诱导形成成骨细胞的潜能进行研究。在胎牛血清浓度为15%的条件下对羊水源干细胞进行建系,并检测其类胚体形成能力;检测不同代数细胞的干细胞标志基因Oct-4、SH2、SSEA-1、Nanog、HLA-ABC、CD117的表达情况;利用地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸等因子进行诱导。结果表明,羊水源干细胞在体外可以持续增殖,悬浮培养形成的类胚体表达三胚层相关标记基因,经诱导可形成成骨细胞。试验成功分离了蒙古羊的羊水源干细胞并建系,且其具有向成骨细胞分化的潜能。     

荷斯坦牛羊水来源干细胞分离培养及其表面标志检测

利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄285 d荷斯坦奶牛胎儿羊水中分离培养干细胞;采用RT-PCR技术检测干细胞表面标志或相关基因。成功分离培养出奶牛羊水来源干细胞,干细胞中CD-90、Nanog、Oct4、TERT、Sox2、Desmin和HES1表达阳性。从奶牛胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,为进行转基因研究提供靶细胞奠定了基础。     

妊娠中期猪羊水来源干细胞EGFP基因转化及体外分化

本研究旨在获得妊娠中期猪羊水来源千细胞,并通过用EGFP对干细胞进行标记,为以EGFP作为示踪标记对干细胞进行体内移植研究奠定基础.利用羊水来源干细胞培养技术体系,从胎龄60 d猪胎儿羊水中分离获得干细胞,通过脂质体介导转染将EGFP基因导入干细胞,诱导转基因干细胞向肌细胞和神经细胞分化,观察其分化特点.采用RT-PCR技术检测干细胞和分化细胞表面标志或相关基因.结果成功分离培养出妊娠中期猪羊水来源干细胞,并获得转EGFP基因干细胞.干细胞在表达EGFP的同时仍具有分化潜能.干细胞中Oct4、CD-90和Sox2表达阳性;体外诱导的干细胞能分化为肌细胞(表达myf-6和myoD)、星形胶质细胞(表达GFAP)、少突胶质细胞(表达GalC)和神经元细胞(表达NF、NSE和MAP2).研究表明,从妊娠中期猪胎儿羊水中分离干细胞具有可行性和有效性,转EGFP基因干细胞具有自我更新、增殖和分化潜能,可以用EGFP对羊水来源干细胞进行标记、追踪,为EGFP作为示踪标记对干细胞用于体内移植研究奠定了基础.     

绵羊羊水、胎儿肾脏组织中表达Oct-4细胞的分离培养及其分子学特性研究简

试验旨在建立从绵羊羊水、胎儿肾脏组织中分离培养表达Oct-4细胞的新方法,同时,通过实时荧光定量PCR（Real-time PCR）初步探索二者在分子生物学特性方面的联系及差异。采用0.01%胰酶培养液,从同一只受孕中期绵羊的羊水和胎儿肾脏组织中各分离1株细胞。Real-time PCR分析结果表明,从绵羊羊水、胎儿肾脏组织中分离的细胞均表达胚胎干细胞相关标志基因Oct-4、胚胎生殖细胞标志基因SSEA-1、主要组织相容性抗原MHC-Ⅱ、细胞凋亡基因Bax及抑制细胞凋亡基因Bcl-2,不表达MHC-Ⅰ、Nanog及TERT,因此,将羊水中表达Oct-4的细胞暂命名为羊水来源多潜能干细胞(amniotic fluid stem cells,AFSC),胎儿肾脏组织中表达Oct-4的细胞暂命名为肾脏组织干细胞(renal tissue stem cells,RTSC)。相对定量分析结果显示,二者的Oct-4、Bax及Bcl-2基因的相对表达量存在明显差异。绵羊羊水中表达Oct-4的细胞（AFSC）和胎儿肾脏组织中表达Oct-4的细胞（RTSC）体外悬浮培养7 d均能形成类胚体。试验成功建立了从绵羊羊水、胎儿肾脏组织中分离培养表达Oct-4细胞的新方法,实时荧光定量PCR分析初步显示绵羊羊水中表达Oct-4的细胞和胎儿肾脏组织中表达Oct-4的细胞具有相同的起源,并在体内处于一种动态的变化之中。     

Establishment of Fetal Large-tailed Han Sheep Fibroblasts Cell Line Transfected with Lipofectamine 2000 Vector Containing TLR4 Gene

Exploiting the method of liposome transfection to obtain modified Toll-like receptors 4(TLR4) gene fibroblast cells as competent donor, build reconstructed embryos, which finally produced transfected TLR4 gene and gender controllable Large-tailed Han sheep by somatic cell nuclear transfer technology.In this study, through primary culturing the fetus dermal fibroblasts from Large-tailed Han sheep, to identify the SRY gene gender.Using the method of liposome transfection transferred TLR4 gene into fibroblast cells, then detected whether TLR4 gene expression stably or not in morphology level and molecular level respectively, transplanting fibroblast cells which stably expressed TLR4 gene into oocytes without nucleus from Large-tailed Han sheep for building reconstructed embryos.To harvest 5 positive clones by fibroblast cells with stable expression level of TLR4.According to the identification of the SRY gene gender, the cell lines were female.The analysis of Real-time fluorescent quantitative PCR, the fourth generation of transfected cells had the highest expression level of TLR4, which were higher than control group in 7.4816 times (P<0.01).The cleavage reconstructed embryos had stable expression level of EGFP.We succeeded in building reconstructed embryos with TLR4 gene and lay the foundation for producing the disease-resistant and gender controllable transgenic sheep in the future.     

利用脂质体法建立转Toll样受体4基因大尾寒羊胎儿成纤维细胞株的研究

利用脂质体转染法获得转Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)基因的成纤维细胞,将其作为供体细胞,再通过体细胞核移植技术构建重构胚,最终生产出转TLR4基因且性别可控的大尾寒羊。本研究通过原代培养大尾寒羊胎儿皮肤成纤维细胞,并进行SRY基因性别鉴定,利用脂质体转染法转入TLR4基因,然后分别从形态学与分子水平检测TLR4基因的表达,将稳定表达转TLR4的成纤维细胞核移植入绵羊去核卵母细胞中构建重构胚。最终获得5个稳定表达TLR4的阳性细胞克隆,经SRY基因性别鉴定为雌性细胞株,通过实时荧光定量PCR分析,在第4代转染的细胞中TLR4表达量最高,比未转染细胞高出7.4816倍(P<0.01),卵裂的重构胚中有EGFP的表达。试验成功构建出含TLR4基因的重构胚,为今后生产出性别可控的抗病转基因绵羊地方新品种奠定基础。     

提高基因转染效率方法的研究

本研究旨在提高基因转染的效率。试验使用聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）介导质粒pEGFP-N1转染NIH-3T3细胞,分为两组,分别进行一次转染和二次转染,于转染48 h后在荧光倒置显微镜下观察。结果显示,部分细胞发出绿色荧光,二次转染组发绿色荧光的细胞明显多于一次转染组,且二次转染法可以明显提高基因的转染效率。     

Neurogenic Differentiation of EGFP Gene Transfected Amniotic Fluid‐Derived Stem Cells from Pigs at Intermediate and Late Gestational Ages

The aims of this study were (i) to determine whether amniotic fluid‐derived stem cells (amniotic fluid‐derived stem; AFS cells) could be isolated from pigs at intermediate and late gestational ages, and (ii) to determine if these AFS cells could be differentiated in vitro into neural lineages following transfection with a reporter gene, enhanced green fluorescence protein (EGFP). Amniotic fluid‐derived stem cells were isolated from embryonic day 60 and day 110 porcine amniotic fluid respectively, and transfected with EGFP gene using lipofection. The transfected AFS cells were induced to differentiate into cells of neuronal lineages. Markers associated with undifferentiated AFS cells and their neural derivatives were tested by polymerase chain reaction. The results demonstrated that porcine AFS cells could be isolated at intermediate and late gestational ages and that transfected AFS expressed EGFP and could be induced to differentiate in vitro. Undifferentiated AFS cells expressed POU5F1, THY1 and SOX2, while following differentiation cells expressed markers for astrocytes (GFAP), oligodendrocytes (GALC) and neurons (NF, ENOS and MAP2).