兴义鸭MEF2C基因启动子区序列克隆与分析

为研究MEF2C基因启动子区SNPs对屠宰性状的影响,本实验运用直接测序法筛选兴义鸭MEF2C基因启动子区的SNP位点,并分析其与屠宰性状的相关性。结果表明:在兴义鸭MEF2C基因启动子上存在8个SNPs位点,分别为T-190A、A-232G、A-285G、A-617T、G-1420A、A-1437C、T-1504G、A-1524G;生物信息学分析发现T-190A、A-232G、G-1420A突变位点周围HOXA4、GCN4、Pit-1a、IRF-1等重要转录因子结合位点消失,继而生成Oct-1、ICSBP 2个新的转录因子结合位点;关联分析结果表明,T-190A不同基因型个体的兴义鸭活重存在显著差异,G-1420A不同基因型个体的兴义鸭腿肌率具有显著差异。由此推断,T-190A、G-1420A位点可能对调控兴义鸭MEF2C基因启动子区功能元件有重要影响,且2个多态性位点可能为影响兴义鸭屠宰性状的重要功能性SNP。本研究结果将为进一步确定MEF2C基因功能提供试验基础。     

牛STAT1基因启动子区多态性研究

 为筛选STAT1基因启动子区SNP及研究其对启动子功能元件的影响。选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,直接测序筛选SNP位点。结果表明：STAT1基因5&;apos;调控区及第1外显子存在3个SNPs位点,分别为：T-537G、T-508A、C+10T。生物信息学软件预测得到STAT1基因核心启动子区和转录因子结合位点,SNP位点导致1个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点。CpG岛范围未受到突变位点影响,但STAT1基因RNA二级结构在突变后显著改变。研究结果为进一步确定STAT1启动子功能奠定试验基础。     

猪PGRMC2基因启动子区多态性的生物信息学分析

本研究以大白猪的基因组DNA为模板,通过混池测序鉴定PGRMC2基因启动子区的多态位点(SNPs),以分析该基因启动子区突变前后转录因子结合位点和Cp G岛的变化。运用生物信息学软件预测其核心启动子区域、转录因子结合及Cp G岛。结果表明:在220头大白猪个体中,检测到PGRMC2基因启动子区存在2个SNP位点,分别为C-1283 T和T-372 C。且这2个SNP均导致PGRMC2基因的转录因子结合发生改变。C-1283 T突变导致1个转录因子结合位点消失(即ASP-CYP21);T-372C突变导致1个转录因子结合位点消失(AP-1-DNA_polyme),9个新的转录因子结合位点产生(E1A-BS5、Trex/MEF3compo、E-box CS、Myo D-MCK-right、NFkappa E1site、NF-mu-E1CS、kappa-E2CS1、lambda5-site F、m TDT-site F等)。由此,推测SNPs可能对PGRMC2基因表达调控发挥重要作用。     

牛α-乳清蛋白基因5'调控区多态性研究

试验选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计1对引物分别扩增2个牛种α-乳清蛋白(alpha-lactalbumin, LALBA)基因5'调控区及第1外显子部分序列总长1126 bp。结果表明,LALBA基因5'调控区存在5个SNPs位点:T-114C、C-166T、A-225C、C-344T、T-778C,T-114C仅在务川黑牛表现多态性。生物信息学软件预测LALBA基因核心启动子区及转录因子结合位点,SNP位点导致11个转录因子结合位点消失,其中1个位于核心启动子区,产生5个新的转录因子结合位点。突变前后RNA二级结构发生明显改变,目标序列未发现CpG岛。     

牛αs2酪蛋白、k酪蛋白基因启动子区多态性研究

为研究牛CSN1S2、CSN3基因启动子多态性.选择品种差异较大的贵州荷斯坦奶牛和务川黑牛构建不同DNA池,设计特异性引物分别扩增2个牛种CSN1S2、CSN3基因5’调控区及第1外显子部分序列.结果表明:CSN1S2基因5’调控区存在3个SNPs位点:A-253T、A-317G、A-407G,CSN3基因5,调控区发现4个SNPs:T-79G、G-415G、T-421C、T-658G,2个牛品种在不同位点的多态性有显著差异.生物信息学软件预测CSN1S2、CSN3基因核心启动子区及转录因子结合位点,CSN1S2基因A-253T、A-317G位于预测核心启动子区.SNP位点造成CSN3基因7个转录因子结合位点消失,而产生10个新的转录因子结合位点.对于CSN1S2、CSN3基因,突变前后RNA二级结构有明显改变,目标序列均未发现CpG岛.研究结果为进一步确定其启动子功能奠定试验基础.     

3个品种猪MEF2D基因启动子多态及其生物信息学分析

研究以从江香猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用混合DNA池结合直接测序技术筛选猪MEF2D基因5'UTR及第1外显子区SNPs位点;同时利用生物信息学软件分析SNPs位点对核心启动子区、Cp G岛和转录因子结合位点的影响。结果表明:在猪MEF2D基因5'UTR区共筛查到4个SNPs位点,分别为A-511G、T-453A、T-242G和T-180A;生物信息学软件预测发现T-453A和T-242G位点附近有重要转录因子结合位点消失和新位点生成,据此推测猪MEF2D基因5'UTR区的T-453A和T-242G位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

贵州地方山羊BMPR-ⅠB基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究骨形态发生蛋白受体ⅠB(bone morphogenetic protein receptorⅠB,BMPR-ⅠB)基因启动子区多态性及其与繁殖性状的相关性,本试验以贵州3个地方山羊品种(黔北麻羊、贵州黑山羊及贵州白山羊)为研究对象,通过构建混合DNA池PCR产物直接测序技术筛选SNPs位点,并采用多种生物信息学软件预测SNPs位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果显示,BMPR-ⅠB基因启动子区存在4个SNPs位点:g.29893005 TC、g.29893016 CT、g.29893729 CG和g.29894370 CT。生物信息学软件预测得到BMPR-ⅠB基因核心启动子区和CpG岛,SNPs位点导致转录因子结合位点发生改变,g.29893005 TC和g.29893016 CT突变使原来的转录因子结合位点Sp1消失;g.29893729 CG突变使原来转录因子结合位点AP-1消失,从而产生新的转录因子结合位点USF;g.29894370 CT突变产生新的转录因子结合位点C/EBPalp,使原来的转录因子结合位点Sp1改变为C/EBPalp和Sp1。由此推测,SNPs位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

贵州黑山羊细胞因子诱导的SH2包含蛋白基因5′调控区SNP研究

本试验为改善贵州本地优良品种贵州黑山羊生长性能,寻找生长相关基因细胞因子诱导的SH2（Src-homology 2）包含蛋白(cytokine inducible SH2-containing protein, CISH)启动子区多态性位点,并研究其对启动子功能元件的影响。将贵州本地优良品种贵州黑山羊构建DNA池,直接测序筛选SNP位点,生物信息学软件预测核心启动子区域、转录因子、CpG岛。结果发现,CISH基因5′调控区存在1个SNP位点为G-95C,得到CISH基因核心启动子区和CpG岛,SNP位点导致附近转录因子新位点产生和原来结合位点消失,但并不改变CpG岛大小。CISH基因5′调控区存在1个对启动子功能元件有较大影响的SNP位点,研究结果为进一步确定CISH基因启动子功能奠定基础。     

贵州地方山羊BMPR-ⅠB基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究骨形态发生蛋白受体ⅠB（bone morphogenetic protein receptor ⅠB，BMPR-ⅠB）基因启动子区多态性及其与繁殖性状的相关性，本试验以贵州3个地方山羊品种（黔北麻羊、贵州黑山羊及贵州白山羊）为研究对象，通过构建混合DNA池PCR产物直接测序技术筛选SNPs位点，并采用多种生物信息学软件预测SNPs位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果显示，BMPR-ⅠB基因启动子区存在4个SNPs位点：g.29893005 T > C、g.29893016 C > T、g.29893729 C > G和g.29894370 C > T。生物信息学软件预测得到BMPR-ⅠB基因核心启动子区和CpG岛，SNPs位点导致转录因子结合位点发生改变，g.29893005 T > C和g.29893016 C > T突变使原来的转录因子结合位点Sp1消失；g.29893729 C > G突变使原来转录因子结合位点AP-1消失，从而产生新的转录因子结合位点USF；g.29894370 C > T突变产生新的转录因子结合位点C/EBPalp，使原来的转录因子结合位点Sp1改变为C/EBPalp和Sp1。由此推测，SNPs位点对调控启动子功能元件可能存在重要影响。     

猪肌分化因子1基因启动子区多态性及生物信息学研究

为揭示猪肌分化因子(myogenic differentiation 1,MyoD1)基因启动子区多态性,本试验分别以野猪×从江香猪二元杂交猪、杜×长×大外三元杂交猪及贵州宗地花猪为研究对象,采用DNA池和直接测序技术,筛选MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区SNP位点,利用生物信息学软件预测SNP位点对核心启动子区、CpG岛和转录因子结合位点的影响。结果表明,在MyoD1基因5'UTR及部分第1外显子区筛查到3个SNPs位点,分别为A-39G、T+150C和C+227G;生物信息学软件预测发现,A-39G位点附近出现重要转录因子结合位点消失和新位点生成;CpGIslandsearcher软件分析得到多态位点突变前后CpG岛大小及GC含量发生改变,据此推测猪MyoD1基因5'UTR区域的A-39G位点对调控启动子功能元件有重要影响。     

山羊角蛋白14基因启动子分析及其多态性研究

以内蒙古白绒山羊DNA为模板,参照牛的角蛋白14(keratin 14,K14)基因序列设计引物,PCR扩增获得长度为2834 bp(GenBank登录号:JQ063036)的片段,包括山羊K14基因启动子区2631 bp和结构基因第1外显子区203 bp。序列比对山羊K14基因启动子序列及其多态性分析结果发现,山羊K14基因启动子结构与人K14基因启动子不同,只含有Sox-5、GATA-1、GATA-1/2结合位点等3个共同的转录因子结合位点。但与牛K14基因启动子有较高的相似性,含有Sox-5、SRY、CdxA、MyoD、MZF1、GATA-1/3、Nkx-2结合位点等7个共同的转录因子结合位点;并发现山羊K14基因启动子区存在deltaE、GATA-2、GATA-1、Sp-1、AML-1a等5处独有的转录因子结合位点。此外,对山羊K14基因启动子进行多态性分析,发现4处单核苷酸多态位点,其中2处SNPs位于Nkx-2(-2004--1996 bp)转录因子结合位点或Nkx-2(-1590--1583 bp)临近几个碱基内。     

海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca²⁺依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1 009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1 009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1 009 bp的启动子5'端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P < 0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。     

山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。