绵羊肺炎支原体的分离与鉴定

绵羊肺炎支原体是一种引起羊传染性胸膜肺炎的病原微生物,它不仅能感染绵羊同时也可感染山羊,发病率和死亡率较高,易给养羊业造成较大损失。近年来,内蒙古境内羊传染性胸膜肺炎也多有发生,为了查明病原,分别在内蒙古一些发病地区采取病料,经分离得到了疑似绵羊支原体菌株7株。对该病原微生物的分离培养、形态学特征、理化特性等进行了阐述,以期为该病的快速诊断及防治提供参考。     

绵羊支原体肺炎诊断及病原的分离与鉴定

通过对送检病羊的临床症状、剖检变化、病料染色镜检,初步诊断为绵羊支原体肺炎。又经无菌采取病料接种改良Frey培养氏液,再取培养液接种于固体培养液后分离到可疑绵羊肺炎支原体。然后将培养生长的支原体分别进行革兰氏染色、姬姆萨染色、瑞氏染色和碱性复红染色;进行了各种生化试验,进行动物和鸡胚接种试验和平扳凝集等血清学试验;最后确诊为绵羊支原体肺炎,并分离获得了绵羊肺炎支原体。该结果为绵羊支原体肺炎的防制奠定了基础。     

绵羊支原体肺炎诊断及病原的分离与鉴定

通过对送检病羊的临床症状、剖检变化、病科染色镜检,初步诊断为绵羊支原体肺炎。又经无茵采取病料接种改良Frey培养氏液,再取培养液接种于固体培养液后分离到可疑绵羊肺炎支原体。然后将培养生长的支原体分别进行革兰氏染色、姬姆萨染色、瑞氏染色和碱性复红染色;进行了各种生化试验,进行动物和鸡胚接种试验和平扳凝集等血清学试验;最后确诊为绵羊支原体肺炎,并分离获得了绵羊肺炎支原体。该结果为绵羊支原体肺炎的防制奠定了基础。     

山羊中绵羊肺炎支原体的分离及鉴定

从四川省乐至县发生胸膜肺炎性传染病的山羊群中采集12个鼻拭子及4个肺组织病料,进行病原分离培养和特异性PCR检测。结果从9个鼻拭子和4个肺组织中分离到支原体,经鉴定均为绵羊肺炎支原体,未发现丝状支原体簇成员及多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。结果表明,绵羊肺炎支原体是引起该山羊群发生胸膜肺炎的病原,同时说明绵羊肺炎支原体也是山羊支原体性肺炎的重要病原之一。     

绵羊肺炎支原体的分离与鉴定

绵羊肺炎支原体是引起绵羊、山羊．特别是羔羊增生性间质性肺炎的病原体．主要危害5～10周龄羔羊．临床上主要表现为咳嗽、流鼻液、呼吸困难等症状。患病羊只消瘦、生长发育迟缓．最后衰竭死亡．死亡率高达30％～50％。病理变化以肺脏的心叶、尖叶、中间叶的间质增生和实质变性为主．此外还引起羊只消瘦、贫血。病程可长达数月至数年．致使出栏率、毛质、毛量下降，并造成饲料和人力的大量浪费．是危害养羊业的主要疫病之一．笔者从疑似该病的绵羊场分离到了1株分离物．初步鉴定为绵羊肺炎支原体。     

从湖羊肺脏中分离绵羊肺炎支原体的鉴定

从新疆湖羊肺脏病料中分离出一株支原体XJ-3f，用其培养物人工感染80日龄健康绵羊，28d后剖杀，剖检可见肺表面肉粉色实变，显微病理变化为大灶性融合性肺炎。参考国际已知支原体16SrRNA序列，设计一对扩增700bp片段的通用引物，直接提取肺脏组织DNA进行PCR扩增并克隆、测序。将该序列与GenBank中33种支原体序列比较，结果证明该序列与绵羊肺炎支原体（M．ovipneumonia）标准株Y．98同源性为99．9％，而与山羊支原体山羊亚种（M．capricolum subsp．capricolum，Mcc）、丝状支原体山羊亚种（M．mycoides subsp．Capri，Mmc）、丝状支原体丝状亚种LC型（M．mycoides subsp．mycoides LC，M．mmLC）等同源率为81％。以感染羊血清和Y．98与从发病羊肺脏中分离出的三株支原体茵体蛋白进行Western blot，证明均与感染羊血清有特异性反应，且与Y．98相比无明显差异，故确定分离株为绵羊肺炎支原体（M．ovipneumonia）。     

绵羊肺炎支原体诊断方法的建立

从青海省海晏县发生胸膜肺炎的绵羊群中采集3份肺组织病料,进行病原的分离培养和特异性PCR检测。结果从3份肺组织中均分离到支原体,经鉴定为绵羊肺炎支原体,表明建立的PCR方法能对绵羊肺炎支原体做出正确诊断。     

绵羊肺炎支原体内蒙古毒株的分离与鉴定

对疑似为患有绵羊肺炎支原体的病羊无菌采取病料,经临床症状、病理剖检、病原分离培养、形态学观察、生化试验、生长抑制试验,代谢抑制试验,人工接种发病,间接血凝试验,对内蒙古克什克腾旗羊群以呼吸道疾病为主要特征的传染病进行初步诊断,参考国际已知支原体16S r RNA序列,选取共同保守性强的片段设计出一对引物,提取病原分离株(MY1)和人工感染分离株(SY1)培养物的菌体DNA进行PCR扩增并克隆、测序。将该序列与Gen Bank中支原体序列比较,结果证明,分离株MY1和SY1与Y-98序列与绵羊肺炎支原体标准株Y-98同源性为99.7%,与丝状支原体山羊亚种标准株PG3同源性为78.7%,故确定分离株为绵羊肺炎支原体。     

宁夏某羊场绵羊肺炎支原体的分离鉴定及病理组织学观察

为了确定宁夏某羊场发生一起以体温升高、咳嗽、呼吸困难为临床特征且具有传染性的疾病的病原,采集濒死病羊的病理组织,应用细菌分离培养、分子生物学鉴定、病理组织学观察及免疫组织化学分析等方法对采集的病料进行病原检测和诊断。结果显示,细菌分离培养获得3株支原体分离株,分子进化分析发现其均属于绵羊肺炎支原体,与国际标准株Y-98的序列一致性为100%。病理组织学观察显示,肺泡上皮细胞坏死、增生,支气管管腔内和肺泡腔内大量炎性细胞浸润,支气管和气管黏膜上皮细胞坏死、脱落、固有层水肿、炎性细胞浸润。对不同脏器的免疫组织化学分析显示,绵羊肺炎支原体主要集中于肺脏和气管内,且肺脏的阳性组织百分比最高,其次是支气管和气管。结合疫病的流行病学调查,该羊场所发疾病为运输应激后感染绵羊肺炎支原体导致,该病原侵染并定植于肺脏、气管及支气管上皮细胞,引起羊严重的呼吸道病症。     

9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因克隆及蛋白序列分析

[目的]克隆绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113基因,比对、分析不同菌株P113蛋白序列,为研究绵羊肺炎支原体P113蛋白的生物学功能提供参考。[方法]设计绵羊肺炎支原体P113基因特异性引物,采用PCR方法扩增9株绵羊肺炎支原体内蒙古分离株的P113基因片段;对获得的9株绵羊肺炎支原体P113基因片段进行测序分析,将DNA序列翻译为氨基酸序列,对不同菌株的P113氨基酸序列进行比对。[结果]不同分离株P113基因片段扩增产物大小不同。氨基酸序列分析显示,C末端序列重复区域长度存在差异,以KKAEGA（S）QNQG为主要重复序列单元。不同菌株重复序列单元数量不同,NM01-MO株和CK-MO株的重复序列单元数量最多,为16个;LK-MO株重复序列单元数量最少,为3个;多数菌株之间重复序列单元数量差异较大。[结论]绵羊肺炎支原体内蒙古分离株P113氨基酸序列的C末端重复序列单元数量不同,这些不同数量的重复序列影响P113蛋白结构,进而可能影响其生物学功能。     

绵羊肺炎支原体内蒙古分离株DnaJ基因克隆表达及其免疫原性研究

[目的] 克隆表达绵羊肺炎支原体DnaJ基因,研究其表达产物的免疫原性。[方法] 以绵羊肺炎支原体内蒙古分离株NM03-MO株基因组DNA为模板,克隆其DnaJ基因序列,对蛋白质序列进行分析比对及三维结构预测;将该基因片段连接至pColdⅠ表达载体,构建pColdⅠ-DnaJ原核表达载体表达重组DnaJ蛋白并纯化,通过Western blot技术检测其与支原体抗体阳性血清的结合活性。[结果] NM03-MO株DnaJ蛋白序列与绵羊肺炎支原体序列同源性最高,但三维结构存在一定差异,重组DnaJ蛋白与绵羊肺炎支原体阳性血清有较好的结合活性,初步证明该蛋白具有免疫原性。[结论] 绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白被首次成功克隆表达,且具有较好的免疫原性,为后续分子致病机制研究及新型疫苗研制奠定基础。     

鸡滑液囊支原体贵州株的分离鉴定及VlhA基因序列分析

【目的】 获得鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)贵州流行株,以进一步开展其病原学及免疫学相关研究。【方法】 从贵州省织金县某肉鸡场共采集107份疑似MS感染病鸡的咽拭子、肿胀关节和脚垫、肿胀组织渗出物进行PCR检测,对PCR筛选的阳性组织样本进行MS分离培养,并进行瑞氏染色、生化试验及VlhA基因序列分析。【结果】 PCR检测筛选到20份阳性样本,从关节和爪垫阳性样本中分离到1株疑似MS,分离株在平板上生长出煎蛋状菌落;瑞氏染色可见蓝色细小的球形菌;生化试验中,分离株分解葡萄糖和麦芽糖,但不分解精氨酸、尿素等,与MS标准株生化结果一致;分离培养物经PCR扩增得到821 bp的目的片段;分离株VlhA基因核苷酸相似性分析表明该分离株为MS,与GenBank登录的国内其他地区流行株相似性有地域差异。与安徽、重庆、福建、广东、广西、湖北、湖南、江苏和云南等地区流行株相似性在90.3%~99.7%之间;该分离株与湖南MS流行株相似性最高,达到99.7%;但与国外参考流行株的相似性低;VlhA基因遗传进化树分析显示,该分离株与国内参考株亲缘关系较近,与国外参考株亲缘关系较远。【结论】 本研究成功从引起关节和足垫肿胀的鸡中分离鉴定了1株MS贵州流行株,该分离株存在一定变异,为贵州省MS的分子生物特征及本病的诊断和防控研究提供了基础依据。     

互助藏羊肺炎病原绵羊肺炎支原体的PCR检测与分析

青海省互助某羊场藏系绵羊发生肺炎疾病,为了快速准确诊断藏羊肺炎发病的致病病原微生物,及时防控和治疗,采集病死绵羊肺样品,利用PCR分子生物学方法进行鉴定与生物信息学分析。经过分子鉴定,此羊场引发肺病的病原是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, MO);测序结果显示样品中鉴定的为同一株病原,鉴定的菌株的16S rRNA基因与参考序列EU265779的同源性达到99.86%。同时遗传进化树显示,鉴定的菌株与GenBank中的绵羊肺炎支原体聚成一大支,其关系最近,在进化角度证实此次鉴定的确实为绵羊肺炎支原体。结果表明,此羊场引发肺炎疾病的病原是绵羊肺炎支原体,提示要对羊群进行相关的病原学研究和流行病学调查,为针对性地对细菌性病原进行对症治疗提供参考。     

绵羊肺炎霉形体的血清学调查

本试验旨在了解绵羊肺炎霉形体在山西省雁北地区的流行状况,为该病的预防和控制提供科学依据,对雁北地区的大同市、朔州市和忻州市的12个县,随机抽取96份血清样本,用间接血凝试验进行血清学检测。共检出37份阳性血清,绵羊肺炎霉形体的总体平均阳性为38.54%,其中忻州市阳性率最高,为44%,朔州市最低,为25%;县(区)阳性率以大同市浑源县最高,达66.7%;饲养方式、环境卫生、动物年龄等对本病的感染均有影响,其中舍饲羊阳性率达50%,高于总体平均阳性率和半舍饲阳性率。结果提示,山西省雁北地区绵羊肺炎霉形体阳性率较高,通风不良和环境卫生较差为主要诱发因素。     

内蒙古地区乳样中牛支原体的分离及PCR鉴定

为检测内蒙古地区某牛场患乳房炎的奶牛乳样中是否存在牛支原体,同时建立直接提取乳样中牛支原体DNA进行PCR检测的方法,本研究无菌采集乳房炎乳样,通过支原体的分离培养、形态学观察和生化试验,初步鉴定分离株为牛支原体,然后提取液体培养基菌体DNA进行牛支原体特异性PCR鉴定,同时,采用Chelex-100法直接提取原乳样中菌体DNA进行PCR鉴定,并测序分析扩增片段序列。液体培养物提取DNA与Chlex-100法直接提取原乳样菌体DNA进行特异性PCR均扩增出目的条带,该片段序列与GenBank中牛支原体oppD/oppF基因的同源性达到99.8%,证实分离株为牛支原体。说明Chlex-100法可直接提取乳样中牛支原体DNA进行快速PCR鉴定。     

绵羊肺炎支原体灭活疫苗的研制

绵羊肺炎支原体引起绵羊及山羊非典型肺炎,分布广泛,危害严重。本试验旨在研制绵羊肺炎支原体灭活疫苗。采用改良Thiaucourt's培养基对绵羊肺炎支原体临床分离株SC02进行培养,收集生长滴度达10⁹ CCU/mL的培养物,浓缩20倍后灭活,制备油佐剂疫苗。选择绵羊肺炎支原体抗体阴性的6月龄健康山羊经颈部皮下接种该疫苗5.0 mL/只(2×10¹⁰ CCU/mL),免疫后21 d,试验组与对照组山羊经气管接种绵羊肺炎支原体强毒Y98株5.0 mL/只(≥2×10¹⁰ CCU/mL),测量体温、观察临床症状,并于攻毒后30 d剖检,观察肺脏病理变化。结果表明,试验组5只山羊均获得免疫保护,全部精神状况良好,临诊和剖检均未见异常;对照组5只山羊出现咳嗽、发热、流鼻涕等症状,剖杀后见肺脏组织有典型的肺炎病理变化。本研究结果表明,该疫苗对山羊有良好的免疫保护作用。