Ⅰ群禽腺病毒通用型二温式PCR和VPCR方法的建立及初步应用

为建立快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-Ⅰ)血清型通用PCR方法,根据FAdV-Ⅰ 12个血清型基因保守区设计引物,建立了二温式PCR和VPCR方法.结果显示:本研究建立的FAdV-Ⅰ二温式PCR方法,在90℃～94℃变性3 s、70℃～74℃退火兼延伸8 s,循环35～40次时,最快可在15 min内完成扩增;对分属5...     

鸭茅SRAP反应体系的建立与优化

为了为鸭茅分子标记辅助育种提供理论依据,研究采用L16(45)正交试验设计,对相关序列扩增多态性(SRAP)-PCR反应体系中的4种主要参数(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物)进行了分析。结果表明:建立的鸭茅SRAP-PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+1.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、引物0.4μmol/L,总体积为25μL。最佳PCR循环条件为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,共5个循环;94℃变性1 min,52℃复性1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;最后72℃延伸10 min;4℃保存。     

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L.)ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl₂,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃(62℃~58℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃;94℃变性30 s,52℃(52℃~48℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。     

绵羊巴贝斯虫PCR检测方法的建立及优化

为建立绵羊巴贝斯虫的最佳PCR检测方法,分别设置退火温度和循环次数的梯度,选取条带最亮且无杂带的温度和循环次数作为PCR检测方法的优化结果,并将新建的PCR法与传统的姬姆萨氏染色镜检法的检测结果进行对比。结果表明:PCR反应的最佳体系为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,56℃退火90 s,72℃延伸1 min,共循环39次;72℃延伸10 min,4℃保存。在50份临床样品的检测中,PCR法检出的阳性样品有13份,阳性率为26%(13/50);姬姆萨氏染色镜检法检出的阳性样品有8份,阳性率为16%(8/50),由PCR方法检测出的阳性样品与姬姆萨氏染色镜检法检出的阳性样品符合率达100%。说明PCR法的灵敏度和准确性高于姬姆萨氏染色镜检法。     

绵羊梨型虫PCR方法的建立及序列分析

本研究建立了绵羊梨型虫的检测方法,并对退火温度和循环次数进行梯度优化。选取条带最亮且无杂带的温度和循环次数作为PCR检测方法的优化结果,将新建的PCR方法与传统的吉姆萨染色法结果进行对比,将阳性的PCR产物进行测序。结果表明:PCR反应的最佳体系为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,56℃退火90s,72℃延伸1min,共循环39次;72℃延伸10min,4℃保存;在50份临床样品的检测中,PCR法检出的阳性样品有13份,阳性率为26%(13/50),吉姆萨染色发检出的阳性样品有8份,阳性率为16%(8/50),由PCR方法检测出的阳性样品与吉姆萨染色发检出的阳性样品符合率达100%。阳性PCR产物的测序结果的同源性分别为100%和98%。本研究证实PCR法的灵敏度和准确性高于吉姆萨氏染色镜检法。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

假俭草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以假俭草为材料,对影响ISSR—PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合假俭草ISSR—PCR分析的最佳反应体系。表明在20弘L总体积中,包含40ng模板DNA、ISSR引物0．4umol／L、dNTPs0．1mmol／L、Mg^2＋1．0mmol／L、0．1U TaqDNA聚合酶和10×buffer 2．0uL。扩增条件为．94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1．5min,35个循环;72℃延伸7min。     

大肠杆菌β-内酰胺酶耐药基因blaTEM,blaSHV,blaCTX-M三重PCR检测方法建立

本研究以我国大肠杆菌中常见的3种β-内酰胺酶耐药基因(bla,TEM blasHV和blaCTX-M)作为目的基因,设计3对特异性引物,建立了blaTEM,bla SHV和blaCTX-M耐药基因三重PCR检测方法.三重PCR反应体系为:10×PCR缓冲液2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L) 2.5 μL,dNTP (2.5 mmol/L)4 μL,blaTEM,blasHV和blaCTX-M上下游引物(25 μmol/L)分别为0.25 μL、0.5 μL、1.0μL,Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.4μL,模板2.5μL,反应总体积为25 μL.反应参数为:94℃5 min,94℃50 s,55℃55 s,72℃1 min,32个循环,72℃延伸5 min.本方法的建立为大肠杆菌中β-内酰胺酶耐药基因的快速检测及分子流行病学调查提供了新的手段.     

东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

珍稀濒危植物裸果木RAPD反应体系优化研究

以裸果木新鲜叶片为材料,采用改进CTAB法提取基因组DNA,在参考一般RAPD分析反应程序的基础上,研究了裸果木RAPD分析过程中的影响因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间等,建立了适于裸果木RAPD反应的PCR体系:模板DNA为4ng/μL,引物浓度为0.3μmol/L,dNTP浓度为0.5mmol/L,Mg2+浓度为2.0mmol/L,Taq酶用量为1U,ddH2O补足25μL;94℃预变性5min,94℃变性45s,36℃退火40s,72℃延伸1min,共30个循环,最后72℃延伸10min,扩增结果稳定。     

钝裂银莲花ISSR—PCR反应体系优化

本研究以改良的CTAB法提取的甘肃合作钝裂银莲花（Anemone obtusiloba）基因组DNA为模板,通过正交和单因素试验,探讨引物浓度、聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度和模板浓度对银莲花ISSR PCR扩增的影响。结果表明,钝裂银莲花ISSR PCR最佳反应体系：总体积20 μL,模板浓度20 ng,聚合酶2 U,Mg2+浓度2.5 mmol·L-1,dNTPs浓度0.3 mmol·L-1,引物浓度0.4 mmol·L-1,引物UBC807退火温度为51 ℃。     

野生盘羊×巴什拜羊杂交二代尾部脂肪差异表达lncRNA的鉴定与分析

【目的】 分析不同脂尾型绵羊尾部脂肪组织中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的表达谱,探究lncRNA与绵羊尾部脂肪沉积机制的关系,为揭示绵羊尾脂沉积机制提供理论依据。【方法】 选择新疆地方绵羊巴什拜羊(肥尾型)和野生盘羊×巴什拜羊杂交二代(小尾型)作为研究对象,采集2个群体尾部脂肪组织,利用转录组测序技术筛选差异表达lncRNA并预测靶基因,对其进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用实时荧光定量PCR技术验证转录组测序的表达结果。【结果】 通过差异表达分析共筛选出728个差异表达lncRNAs,其中270个表达下调,458个表达上调;通过差异表达lncRNA靶基因的GO功能和KEGG通路富集分析,筛选到634个靶基因参与疾病、免疫、蛋白修饰、细胞代谢等相关功能分类,共涉及76条信号通路,部分lncRNA介导的靶基因SCD、GPAM、THRSP、FASN等与绵羊尾部脂肪沉积相关。实时荧光定量PCR与转录组测序结果趋势相同。【结论】 lncRNA在绵羊脂尾进化中对尾部脂肪沉积具有重要的调控作用,为从lncRNA的角度分析绵羊脂肪沉积提供了理论依据。     

小叶锦鸡儿SSR-PCR体系优化及应用

为建立适宜小叶锦鸡儿（Caragana microphylla）SSR PCR的反应体系,利用正交试验设计L16(45),对模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶的浓度进行五因素四水平优化筛选,确立最佳反应体系和扩增程序。即在25 μL反应体系中包括：40 ng模板DNA,3 mmol/L Mg2+,300 μmol/L dNTP,0.6 μmol/L引物,1 U Taq DNA聚合酶,1×Buffer。扩增反应程序为：94℃10 min;94℃ 45 s,65℃ 1 min,72℃ 1 min,10个循环,每循环的复性温度递减1℃;94℃ 45 s,55℃ 1 min,72℃ 1 min,30个循环;72℃ 10 min,4℃保存。应用该优化体系对小叶锦鸡儿种质资源及不同引物进行了检验及筛选。本研究表明,该体系的建立为今后利用SSR标记对小叶锦鸡儿属遗传多样性研究、遗传图谱构建及种质资源鉴定等研究工作提供依据。     

结缕草SSR反应体系的正交优化

为了快速获得结缕草(Zoysia japonica)SSR反应体系,采用5因素(模板DNA,Mg2 ,dNTP, Taq酶和引物)4水平正交设计筛选合适的结缕草SSR体系,并通过随机挑选3对Tm相近的引物对该优化体系进行验证.结果表明:正交设计可应用于SSR-PCR反应体系的优化,20 μl最佳PCR反应体系中包括2 μl 10×buffer、1.0U Taq酶、0.2 mM 引物、100 ng模板DNA、0.2 mM dNTP、2.0 mM Mg ;对结缕草进行梯度退火实验,其最佳退火温度为56～58℃;可行扩增程序是:94℃预变性4 min、进行35个循环的94℃变性30 s、56～58℃退火40 s,72℃延伸1 min;72℃延伸10 min,4℃保存;该最适反应体系的建立,为今后结缕草SSR分析奠定了坚实基础.     

牛疱疹病毒gD-PCR鉴别检测方法的建立

建立一种PCR技术,既能快速检测疱疹病毒1型成员牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitisvirus,IBRV),又能区分牛疱疹病毒5型和伪狂犬病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gD基因序列,应用primer 5.0软件设计了gD PCR引物,建立PCR方法,反应条件是:94℃预变性5min,94℃1min,58℃1min,72℃1min,30个循环,72℃7min,4℃5min。该方法能从IBRV阳性样本和参考毒株中扩增出372bp的目的片段,而从同属的牛疱疹病毒5型中扩增出440bp和206bp两条目的片段,从同属的伪狂犬病毒中扩增出303bp的目的片段,但不能从非疱疹病毒属成员猪呼吸与繁殖综合征病毒中扩增出目的条带。该PCR检测IBRV的灵敏度可达1PFU/mL以上。鉴于其灵敏度高、特异性好,可望在牛疱疹病毒感染快速鉴别检测方面发挥重要作用。     

山生柳SSR-PCR反应体系优化

本研究以祁连山4个海拔梯度的山生柳（Salix oritrepha）为材料,采用L9(34)正交试验设计和单因子试验,分析山生柳SSR技术中PCR体系的主要成分对扩增结果的影响,并对引物SHUK123的适宜退火温度进行优化。结果表明,PCR反应体系的最佳条件:20 μL体系中2.0 mmol·L-1 Mg2+ 1 μL,0.10 mmol·L-1 dNTPs 1.5 μL,0.5 U Taq酶用量为1 μL,20 ng·μL-1 DNA模板1 μL, 0.5 μmol·L-1的上下游引物各2 μL,10× Taq Buffer 2 μL,ddH2O加至20 μL。扩增反应程序：94 ℃高温预变性时间3 min,94 ℃变性45 s,Tm(不同退火温度)退火时间45 s,72 ℃延伸30 s,循环数30个,最后72 ℃后延伸时间5 min,4 ℃保温。适宜退火温度为56 ℃。以上结果表明,此反应体系在山生柳PCR扩增中的稳定性和可重复性较好。     

巨型玫瑰冠鸡H-FABP、A-FABP基因表达的发育性变化及其肌内脂肪含量研究

为探讨心脏型脂肪酸结合蛋白（heart-type fatty acid-binding protein，H-FABP）和脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein，A-FABP）基因与巨型玫瑰冠鸡生长发育及肌内脂肪含量（IMF）的关系，研究H-FABP、A-FABP基因对巨型玫瑰冠鸡IMF含量和腹脂沉积的作用机制，本试验采集了巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡在不同周龄（2、4、6、8、10、12周龄）的腹脂、心肌、胸肌、腿肌组织样品共480份，采用实时荧光定量PCR对巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡不同生长阶段组织中H-FABP、A-FABP基因mRNA表达量进行了检测，并采用索氏浸提法测定了两种鸡12周龄的胸肌与腿肌的IMF含量。结果表明，巨型玫瑰冠鸡与良凤花鸡的H-FABP、A-FABP基因mRNA在腹脂、心肌、胸肌和腿肌组织中均有不同程度的表达，且两种鸡H-FABP基因mRNA在心肌组织中高度表达，在脂肪组织中表达量较低，在胸肌、腿肌组织中中度表达，而A-FABP基因相反，推测H-FABP基因主要在肌肉组织中表达，而A-FABP基因主要在脂肪组织中表达。良凤花鸡生长速度高于巨型玫瑰冠鸡；巨型玫瑰冠鸡的腹脂率均低于同性别的良凤花鸡，但胸肌、腿肌的IMF均高于同性别的良凤花鸡，表明巨型玫瑰冠鸡的肉品质优于良凤花鸡。本试验结果为巨型玫瑰冠鸡H-FABP、A-FABP基因分子选育奠定了基础。