玉米V-ATPase B亚基基因(ZmVHA-B)的克隆及其表达分析

根据玉米基因组数据MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)已经公布的玉米VHA-B(V-ATPase subunit B)基因的mRNA序列(AY104180),从干旱处理玉米材料CN165的花丝中利用RT-PCR技术获得VHA-B基因的编码序列,并进行了序列分析和Northern杂交分析。结果表明：VHA-B基因编码487个氨基酸,含有1个保守的ATP结合位点,其编码的蛋白分子量为54.09 kD,等电点为4.99。氨基酸同源性分析表明：V-ATPase B亚基是一个较为保守的蛋白亚基。Northern杂交结果表明：在干旱处理下,B亚基存在两个不同的转录本,它们对干旱的响应不同;在盐胁迫下,同样也存在两个转录本,它们都对盐胁迫做出了响应;在冷处理下,仅存在1个转录本,且它的表达较强,仅仅在6 h有一些微小地反复;在ABA处理下,也仅存在1个转录本,处理1 h后表达明显上调,此后一直保持较高的表达水平。玉米VHA-B基因对花期干旱有响应,但在花丝和雌穗中的表达响应方式不同,在花丝中干旱诱导表达明显,而在雌穗中存在表达没有明显差异的两个转录本。     

玉米逆境胁迫响应基因ZmbZIP15的克隆与抗旱功能分析

从转录组数据中筛选到27个参与干旱-复水胁迫响应的bZIP基因,构建共表达网络图。结果发现,ZmbZIP15处于核心节点位置,该基因位于第5号染色体,编码176个氨基酸,包含高度保守的bZIP结构域,属于亲水性蛋白。蛋白进化树分析发现,该蛋白与芒草、高粱的亲缘关系最近,与大麦、小麦的亲缘关系最远。ZmbZIP15基因ATG上游2 K启动子的顺式元件分析,发现含有多个参与调控脱落酸、低温和干旱的结合元件。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,ZmbZIP15是组成型表达基因,在雌穗高表达,幼茎的表达量最低。干旱、高温、盐、氮胁迫处理下,该基因的表达量显著上调,说明ZmbZIP15基因积极参与并调控非生物胁迫途径。过表达ZmbZIP15转基因拟南芥抗旱性检测分析,发现干旱胁迫处理下过表达ZmbZIP15基因能够提高拟南芥幼苗的抗旱性。亚细胞定位显示,该基因编码的蛋白定位于细胞核。     

橡胶树PGAM基因的克隆及表达特性分析

从橡胶树中克隆并获得磷酸甘油酸变位酶基因（HbPGAM）,该基因的cDNA序列全长1 559 bp,包含长度为1 260 bp的完整开放阅读框,编码一个由419个氨基酸残基组成的蛋白,氨基酸同源性分析发现,该蛋白含有保守的磷酸变构酶组氨酸磷酸酶结构域,属于磷酸甘油酸变位酶。生物信息学分析显示,HbPGAM蛋白无导肽酶切位点,不具有跨膜结构域且为亲水蛋白,该蛋白可能在细胞质中发挥作用。实时荧光定量PCR分析表明,HbPGAM基因在分析的7种组织中均表达,但在胶乳（产胶细胞乳管的细胞质）中的表达水平最高,且该基因在胶乳中的表达受割胶影响,推测其参与橡胶树胶乳再生过程。此外,HbPGAM基因表达受部分植物激素如乙烯利ET、植物生长素2,4-D及水杨酸SA调控,但调控不明显。结果说明,胶乳再生过程中HbPGAM对胶乳糖酵解起到一定的调控作用,为全面了解橡胶树PGAM家族奠定理论基础。     

玉米株型相关基因ZmDwarf2的克隆及表达分析

以玉米紧凑型自交系豫82、平展型自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆了与水稻Dwarf基因同源的玉米Dwarf2基因,该基因水稻上通过参与BR生物合成途径调控其株型形态建成。序列分析发现,玉米Dwarf2基因cDNA序列全长1 501bp,开放阅读框1 398bp,编码465个氨基酸。与水稻Dwarf基因的同源度达84%。实时荧光定量PCR分析表明,豫82、沈137中Dwarf2基因表达趋势基本一致,3～4叶期表达量低,8～12叶期处于表达高峰,13叶期后表达量逐渐下降。沈137中表达量较豫82高;就不同器官来说,沈137在叶片、叶枕、叶鞘、茎尖等器官中表达量较豫82高,其中,叶枕处ZmDwarf2表达量相对较高,而叶鞘上ZmDwarf2表达量相对较低。可以推测,基因ZmDwarf2可能参与玉米中BR生物合成途径,进而调控其相关株型形态建成。     

玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1 992 bp,开放阅读框为2 352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。     

玉米PRC2基因在子粒发育过程中的表达分析

以玉米自交系昌7-2授粉后不同天数的玉米子粒为研究对象,通过实时荧光定量PCR技术,对玉米中3个Polycomb Repressive Complex 2基因(PRC2)Mez1(Maize enhancer of zeste 1)、Fie1(Fertilization independent endosperm 1)和Vef101(VEF family protein 101)在授粉后不同天数的表达情况进行研究。结果表明,Mez1、Fie1和Vef101在授粉后子粒发育不同阶段均有表达,Fie1在子粒发育过程中呈先上升后下降的趋势,授粉后10 d表达量最高,表明Fie1可能在子粒由胚胎形成到干物质积累的过渡时期发挥调控作用;Mez1在子粒发育过程中呈先下降后上升的趋势,授粉后10 d表达量最低,子粒发育后期表达量明显上升,表明Mez1可能在子粒淀粉积累过程中发挥调控作用;Vef101只在授粉后5 d的子粒中呈现高表达,其他时期表达量均较低,表明Vef101可能在玉米子粒发育早期胚胎形成过程中发挥调控作用。     

玉米ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子的克隆与序列分析

根据已知玉米全基因组序列设计引物,采用PCR方法从基因组DNA中克隆两种玉米材料的Zm-NAS1和ZmNAS2基因启动子,利用生物信息学软件对启动子元件进行分析预测并比较在两种材料间差异。结果表明,ZmNAS1基因启动子在两种材料上差异明显,沈137较K12除一段574bp缺失外,他们之间还有24处单核苷酸多态性位点;两种材料间的ZmNAS2基因启动子无差异。ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子均具有一些与光调控、激素诱导、响应逆境胁迫等有关的顺式作用元件,但数目存在一定差异;两个基因启动子上都有一定数目缺铁诱导元件的核心序列。根据启动子元件分析,初步判断ZmNAS1和ZmNAS2基因除受缺铁诱导表达外,还可能受到其他多种信号的共同调控,是一个复杂的调控过程。此外,ZmNAS1基因启动子在两种材料间差异明显,推测该基因在两种材料间受到的表达调控水平也不相同。     

玉米转脂蛋白基因ZmLTP3的克隆及表达特性分析

转脂蛋白(Lipid transfer proteins,LTPs)是广泛存在于植物中的一类小分子蛋白,在植物生长发育及逆境应答中起着十分重要的作用。通过RT-PCR方法从玉米中克隆1个与拟南芥LTP3基因同源的全长cDNA,命名为ZmLTP3。推测ZmLTP3蛋白含有123个氨基酸,分子量为12.5 kDa,等电点为9.38。半定量RT-PCR分析表明,ZmLTP3可以被甘露醇、高盐和水杨酸(SA)诱导。在不同组织中ZmLTP3的表达模式不同,在子房中的表达量最高。结果表明,ZmLTP3可能在植物逆境反应及生殖生育过程中起多重作用。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

过量表达玉米ZmPto/ZmPti1基因对拟南芥基因的差异表达研究

利用拟南芥基因芯片检测ZmPto/ZmPti1共表达转基因拟南芥的基因表达情况,了解Pto/Pti1信号途径的下游组分,对Pto/Ptil的作用机制做进一步探讨.结果表明,与野生型株系比较上调表达两倍的基因有84条,与野生型株系比较下调表达两倍的基因有95条.在上调表达的基因中有9条与非生物逆境有关,其中有SOS系统中的SOS3、DREBIA、WRKY15等;有3条与生物逆境有关,分别为AT4G36010、AT5G01870、AT5G64120;与生长发育有关的有12条;与脂类吸收、转运、代谢相关的基因6条;转录因子9条.在下调表达的基因中与非生物逆境有关的基因有4条;与生物逆境有关的基因2条;发育调控的基因8条;转录因子2条.无论上调还是下调表达的基因中,都有很多未知功能的基因.ZmPto/ZmPti1同时过表达显著影响植物对非生物逆境的响应、生长发育等过程,同时对脂类的吸收、转运、代谢等过程也有显著影响.     

玉米大斑病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因克隆和表达分析

利用RT-PCR技术克隆玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)的GAPDH基因StGAPDH。该基因c DNA全长1 014 bp,编码337个氨基酸;蛋白质分子量36 505.44,理论pI值6.72,属弱酸、亲水、稳定蛋白,无跨膜结构域和信号肽。亚细胞定位于细胞质、线粒体和细胞核的概率分别为43.5%、30.4%和21.7%;氨基酸序列高度保守,在亲缘关系上与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)和水稻胡麻斑病菌(Bipolaris oryzae)最近。荧光定量PCR分析表明,在病菌接种抗病玉米自交系3 d时,StGAPDH基因表达量显著高于接种5～10 d(P<0.05);接种感病玉米自交系时,接种10 d的StGAPDH基因表达量显著高于接种3～7 d(P<0.05)。     

玉米中RING型E3泛素连接酶基因ZmGW2的表达分析

前期研究克隆得到ZmGW2基因, 该基因与水稻粒重相关基因OsGW2同源, 编码一个RING型E3泛素连接酶。研究表明, 该基因位于玉米的百粒重相关的QTL区域, 并且其表达量与玉米粒宽呈显著负相关。通过荧光定量PCR研究分析ZmGW2在杂交优势系中的表达量, 结果验证该基因的表达与玉米粒重呈负相关。半定量RT-PCR分析该基因在逆境胁迫下的表达模式, 结果表明, ZmGW2基因还可以被高盐(NaCl)、干旱、低温(4℃)和脱落酸(ABA)等逆境胁迫诱导表达。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease,CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一,广泛参与植物的各种生理过程;TaCP3属于papain-like(木瓜蛋白酶)家族的半胱氨酸蛋白酶,在小麦的生长发育及抗逆中起到重要作用。为研究 TaCP3基因的结构特征,以及在干旱、高盐、低温和高温胁迫下的表达情况,从小麦抗旱品种西农538中克隆了 TaCP3基因,该基因仅含1个1125 bp的开放阅读框,编码374个氨基酸,在蛋白氨基端有一个28个氨基酸残基组成的信号肽,羧基端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。生物信息学分析表明, TaCP3与大麦和山羊草半胱氨酸蛋白酶基因相似性最高。同时,本研究构建了pcold-TF/TaCP3原核表达载体,通过转化大肠杆菌BL21(DE3),成功表达了TaCP3重组蛋白,分子量约为40 kD。qRT-PCR结果表明, TaCP3的表达对干旱、高盐、低温和高温胁迫均有响应,初始都呈先降后升的趋势;且对干旱胁迫有强烈的正向响应。     

玉米ZmFAR1基因的克隆与表达分析

FARs为脂酰辅酶A还原酶,在植物生长发育和抵御非生物胁迫过程中起着重要作用。为进一步研究FARs在玉米中行使的生物学功能,在玉米中克隆1个脂酰辅酶A还原酶1基因(ZmFAR1),该基因全长1 883 bp,开放阅读框长1 491 bp,编码496个氨基酸,分子量为55.983 k Da。生物信息学分析表明,ZmFAR1蛋白的分子式为C₂₅₂₂H₄₀₁₀N₆₉₀O₇₀₁S₂₄,为稳定的碱性亲水蛋白,存在59个磷酸化位点,未发现信号肽,存在跨膜结构域,最大可能定位于细胞质。氨基酸残基组成中主要以α螺旋和无规则卷曲为主。系统进化树分析表明,ZmFAR1蛋白与南荻和高粱的FAR蛋白相似度最高。利用实时荧光定量PCR技术对ZmFAR1在模拟盐、干旱两种非生物胁迫条件下对根、茎、叶3种组织的表达模式进行研究,结果表明,ZmFAR1呈现组织特异性表达,在叶中的表达量最高。盐和干旱处理下,ZmFAR1的表达量出现明显变化,推测ZmFAR1可能在不同程度参与了玉米对非生物胁迫的应答。     

玉米opaque2近等基因系中相关基因的表达量分析

Opaque2(O2)基因编码产生OPAQUE2蛋白,该蛋白为碱性亮氨酸拉链家族的一种转录因子,可作用于基因的启动区,调控基因的转录。辽2345/o2为本实验室构建的辽2345的opaque2(o2)基因回交导入系,蛋白组学分析表明,辽2345与辽2345/o2在授粉后18 d的胚乳细胞中表达蛋白的种类和数量存在很大差异,从中筛选出差异较明显的9种蛋白质。为了进一步验证O2与9种蛋白间的作用关系,应用相对荧光定量PCR的方法对9种蛋白进行了RNA水平表达量的检测。结果表明,在胚乳发育过程中Chfi很可能受到O2的抑制作用,O2很可能对Ubc、Lgl、Sdh、LOC541920、Shmt、Ppdk等基因存在某种促进或激活作用。     

非生物胁迫诱导的玉米蛋白激酶基因ZmCIPK3的cDNA克隆和表达特性

类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(calcineurin B-like calciumsensor interactingProtein Kinase,CIPK)在植物非生物胁迫信号转导中起重要作用。应用分子克隆的方法在玉米(Zea mays)中克隆了一个cDNA全长为1 350 bp的蛋白激酶基因ZmCIPK3(GenBank登录号为EU873319)。其编码的蛋白含有449个氨基酸,分子量为50.89kD,等电点为8.26。推断的ZmCIPK3催化结构域中包含蛋白激酶催化结构域保守的11个亚结构域,蛋白C端具有植物CIPK蛋白家族特有的包含24个氨基酸的NAF结构域。半定量RT-PCR结果表明,在玉米幼苗叶片中,ZmCIPK3响应甘露醇、氯化钠、ABA和4℃低温的诱导,其转录水平在12 h内呈上升趋势。ZmCIPK3是一个新的玉米蛋白激酶基因,响应多种非生物胁迫信号。