甘蔗叶绿体分离及其蛋白质提取方法研究

【目的】探索甘蔗幼苗叶片完整叶绿体的分离纯化及其叶绿体蛋白质提取方法,为深入研究甘蔗叶绿体蛋白质组学奠定基础。【方法】以甘蔗品种ROC22幼苗叶片为材料,通过差速离心法制备粗叶绿体制品,分别利用蔗糖密度梯度离心和Percoll梯度离心进一步分离纯化完整叶绿体;提取叶绿体蛋白质,并进行电泳分析。【结果】两种密度梯度离心法均可获得纯度和完整率较高的叶绿体,但蔗糖密度梯度离心法具有分离时间较短、成本较低,分离的叶绿体完整率、纯度和含量高等特点,并且提取的叶绿体蛋白质电泳条带清晰,蛋白质数量多且较全。【结论】与Pecoll梯度离心法相比,蔗糖密度梯度离心法更适宜于在亚细胞水平上进行甘蔗蛋白质组学研究。     

玉米叶绿体蛋白质提取及其双向电泳体系建立

为了获得纯化、完整的玉米叶绿体蛋白质,以玉米品种郑单958为试验材料,利用差速离心与蔗糖密度梯度法分离叶绿体,并对其纯度和完整度进行检测;通过光学显微镜直接观察叶绿体的形态结构并测定过氧化氢酶的活性及Hill反应速率,证明已分离出纯度较高、完整的叶绿体。随后采用2种不同的蛋白质提取方法分别提取玉米叶绿体总蛋白质,并用Bradford法进行蛋白质定量,SDS-PAGE电泳结果表明,TCA丙酮沉淀法对玉米叶绿体蛋白质的提取不充分,而TCA丙酮与酚抽提相结合法明显比TCA丙酮沉淀法效果好,提出的叶绿体蛋白质的条带数目多,丰度较高,并得到了较理想的玉米叶绿体双向电泳图。     

泡桐叶绿体游离及其DNA提取方法的筛选

为了深入研究泡桐叶绿体基因组以白花泡桐组织培养苗为材料,利用蔗糖密度梯度离心法、差速离心法和高盐低pH 值法3种叶绿体游离方法提取叶绿体DNA ,其质量浓度分别为92．1、968．9、175．9 ng/μL。经显微镜观察、凝胶琼脂糖电泳检测,结果表明,先差速离心提取粗叶绿体,再用蔗糖密度梯度法对其进行纯化,然后使用SDS法提取所得的叶绿体DN A纯度较高,此方法可用于叶绿体基因组的研究。     

大鼠胰岛的分离、纯化与评价方法改良

【目的】简化胰岛的分离纯化方法,建立完善的胰岛评价体系。【方法】采用Ⅴ型胶原酶分离出Spra-gue-Dawley大鼠胰岛,并采用改良的3层Dextran不连续密度梯度离心法纯化胰岛。纯化的胰岛通过双硫腙(Dithi-zone,DTZ)染色进行计数及纯度检测,丫啶橙(AO)-碘化丙啶(PI)双染色法确定分离细胞的存活率,体外葡萄糖刺激释放胰岛素试验检测胰岛的分泌活性。采用Adobe Photoshop程序改进了常规的胰岛计数方法,并进行胰岛标准计数。【结果】平均每只成年Sprague Dawley大鼠的胰腺,可获得(3 840±24)当量数(IEQ)纯化胰岛,纯度可达到90%,细胞平均存活率达92%。【结论】采用改良的3层Dextran不连续密度梯度离心法及基于Adobe Photoshop程序的标准计数方法,可分别用于大鼠胰岛分离纯化和计数。     

适合于基因组测序的红麻高纯度线粒体DNA提取

采用红麻黄化苗为试材,结合密度梯度离心和差速离心的方法提取线粒体DNA(mtDNA)以满足测序要求.结果表明,蔗糖密度梯度离心法比Percoll密度梯度离心法更适合于红麻线粒体的分离.分离后的线粒体经DNaseI消化核DNA,并采用Jannus绿检测线粒体的完整性,SDS和蛋白酶K裂解线粒体,并用酚/氯仿抽提除去蛋白,...     

利用双向电泳技术分离节瓜叶片总蛋白的方法研究

【目的】建立适合节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系.【方法】以节瓜品种"A37毛节瓜"为材料,对蛋白质抽提方法、上样量、凝胶浓度及IPG胶条pH范围等关键因素进行探索与优化.【结果和结论】与TCA/丙酮沉淀法及酚提取法相比,改良酚提取法抽提蛋白质总量较高,纯度最高,SDS-PAGE电泳条带明显、清晰,双向电泳图谱蛋白质点最多、清晰均匀、纵横条纹少.利用17 cm pH 4~7范围IPG胶条、120μg蛋白质上样量、12%凝胶浓度,硝酸银染色获得蛋白质点数丰富、分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,检测到节瓜叶片蛋白质点1 936个,相对分子质量主要分布于15 000~100 000之间.初步建立了一套适用于节瓜叶片蛋白质组学研究的双向电泳体系,为后续开展蛋白质组学研究及其相关工作奠定了基础.     

柽柳液泡膜微囊蛋白的分离

采用差速离心和不连续蔗糖密度梯度离心法分离和纯化柽柳液泡膜微囊,通过western杂交对获得的微囊蛋白进行检测,获得Th VHAc1蛋白目的条带,表明分离的液泡膜微囊中含有有效的V-ATPase成分,进一步测定液泡膜微囊对Na NO3、Na3VO3、Na N3的敏感性及V-ATPase的水解活性和翻转比例。结果表明:液泡膜微囊主要分布在0~25%蔗糖梯度界面上,且研磨法提取液泡膜微囊具有较高的水解活性和较大的原位比例,表明液氮研磨结合差速离心及不连续蔗糖密度梯度离心法能有效提取柽柳液泡膜微囊。     

黄瓜叶片细胞壁蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立一套适合黄瓜叶片细胞壁蛋白质组学研究的双向电泳体系,为黄瓜细胞壁蛋白质组学的后续研究奠定基础。【方法】以黄瓜品种"长春密刺"幼苗叶片为材料,比较2种不同提取介质(CaCl2和LiCl溶液)对细胞壁蛋白的提取效果,对比IPG胶条梯度、裂解液、上样量及等电聚焦程序对黄瓜叶片细胞壁蛋白双向电泳结果的影响。【结果】以0.2mol/L CaCl2和3mol/L LiCl溶液依次提取黄瓜叶片细胞壁蛋白,选用17cm pH 3~10NL IPG胶条和裂解液Ⅱ(7mol/L尿素、2mol/L硫脲、40g/L CHAPS、10g/L DTT和1mmol/L PMSF),上样量800μg,按聚焦程序Ⅰ(20℃水化14h,100V30min,250V30min,500V30min,1 000V1h,线性升压5h至10 000V,10 000V聚焦6.5h)聚焦后进行双向电泳分离和考马斯亮蓝G-250染色,可获得重复性好、分辨率高的双向电泳图谱。【结论】建立并优化了适合于黄瓜叶片细胞壁蛋白质组学分析的双向电泳体系。     

手足口病EV71疫苗纯化的工艺

为提高肠道病毒71型(EV71)疫苗的纯化工艺,采用粗纯、4FF层析、离子交换层析、蔗糖密度梯度离心等方法进行疫苗的纯化。结果表明,粗纯的EV71浓缩液经4FF层析和蔗糖密度梯度离心,得到高纯度的EV71疫苗。新工艺提高了EV71的纯度,适用于规模化生产。     

一种家蚕后部丝腺高纯度线粒体提取方法

为了从家蚕后部丝腺中提取高纯度的线粒体,采用差速离心和非连续Percoll密度梯度离心方法,分离和纯化家蚕后部丝腺线粒体,并通过电镜观察和蛋白免疫印迹验证提取效果。结果表明,采用该方法分离的线粒体杂质少、纯度高,并且线粒体内外膜结构完整。该研究建立了一种提取家蚕后部丝腺线粒体的方法,为进一步研究线粒体在家蚕后部丝腺中的功能奠定了基础。     

绿色蔬菜叶绿体DNA的提取和纯化

对蔬菜绿叶通过组织匀浆,差速离心分离,密度梯度离心分离、纯化、提取叶绿体。显微镜下观察所得叶绿体纯度、形态及结构,看到椭圆、球形叶绿体,并用数码照相机拍照。样品用SDS、蛋白酶K、核酸酶处理后,用酚、苯酚/氯仿及氯仿/异戎醇抽提、处理纯化。取得的叶绿体DNA(ctDNA)用紫外分光光度计检测浓度与纯度,1%琼脂糖电泳得到清晰、整齐的条带。     

堆型艾美耳球虫子孢子纯化

笔者通过比较不同成分脱囊液的子孢子脱囊效果和不同蔗糖密度梯度分离纯化堆型艾美耳球虫子孢子的纯化效果来探索较佳的分离纯化堆型艾美耳球虫子孢子的条件。通过试验证明10%鸡胆汁+0.75%(W/V)胰酶脱囊效果最好。75%(W/V)和20%(W/V)蔗糖密度梯度离心得到的子孢子回收率最高,且纯度最好,染色证明纯化后的堆型艾美耳球虫子孢子仍具有较高的活性。     

大鲵虹彩病毒的分离纯化及其MCP基因序列分

【目的】确定陕西省略阳县某大鲵养殖场高致死性疾病的病原,分析其主要衣壳蛋白(MCP)的基因特征。【方法】采集患病大鲵,观察其临床症状,取其脏器组织,处理后分别分离细菌和接种鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞,观察细胞病变,分离病毒;对病原进行增殖,采用蔗糖密度梯度(20%,30%,40%,50%,60%)离心法进行纯化,电镜观察纯化样品。克隆分离病毒的MCP基因,测定其序列并进行系统进化树分析。【结果】患病大鲵背部有溃疡、头部胀大且有出血点,尾部有轻微的溃烂。取病鲵内脏组织样品分离病原,未分离到细菌;处理的内脏组织感染EPC细胞,出现细胞病变。电镜观察证实,在蔗糖密度梯度为50%~60%的样品中,病毒粒子的纯度最高,且结构较为完整;病毒粒子的直径约150nm,与虹彩病毒相似。MCPPCR扩增得到了预期长度(1 392bp)的特异性产物。NCBI BLAST结果显示,扩增的MCP序列与蛙病毒属的感染性造血器官坏死病毒(EHNV)、食用蛙病毒(RSV)、普通产婆蟾病毒(CMTV)以及梭鲈虹彩病毒(PPIV)的MCP全长的同源性最高,达到99%;与中华鳖虹彩病毒(STIV)、蛙病毒3型(FV3)、虎纹蛙虹彩病毒(RTV)等MCP全长的同源性为98%。系统发育分析结果显示,导致该例大鲵发病的病毒为蛙病毒属的虹彩病毒。【结论】造成陕西省略阳县某大鲵养殖场大鲵大量死亡的病原为蛙病毒属的虹彩病毒,将该株病毒命名为大鲵虹彩病毒略阳分离株(CGSIV-LY1112)。     

梨叶片总蛋白提取及双向电泳体系的建立

【目的】探索建立有效的梨叶片蛋白质组双向电泳体系,为梨蛋白质组的后续研究提供参考。【方法】以早酥梨叶片为材料,比较蛋白质提取方法、蛋白质裂解时间、IPG胶条的pH梯度和长度、等电聚焦程序及SDSPAGE电泳参数对梨叶片蛋白双向电泳结果的影响。【结果】采用第2种改良的三氯乙酸（TCA）/丙酮沉淀法提取梨叶片总蛋白,蛋白质裂解1 h,选用长17 cm、pH 4～7的IPG 胶条及聚焦程序Ⅱ进行等电聚焦,于100 V 30 min、180 V 6 h条件下进行SDS-PAGE垂直电泳,可以获得背景清晰、重复性好的双向电泳图谱。【结论】建立并优化了适用于梨叶片蛋白质组分析的双向电泳体系。     

用Dextran T—70和蔗糖分离猪血脑屏障微血管的效果比较

以Dextran T-70和蔗糖为分离液，经组织匀浆、差数和密度梯度离心、玻璃柱色层过滤等步骤，从猪大脑组织中分离得到脑微血管内皮细胞，建立体外血脑屏障研究模型，并用显微分析技术和测定γ－谷氨酰转肽酶，5′－核苷酸酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶等标志酶活性，鉴定该模型的纯化程度和完整性及生物学活性。结果表明，用两种分离液均能分离得到完整性好、纯度和生物学活性均高的微血管内皮细胞，尤其是用Dextran T-70制备的微血管，其生物学活性和纯度高于用蔗糖离心所得的微血管。这些制备物可用于研究血脑屏障的代谢、结构、功能以及蛋白质激素的作用机制。     

秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞的分离培养

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P0.05),但细胞存活率较低(P0.05);而采用Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法可以得到相对较高的细胞数及存活率。利用差速贴壁和Percoll密度梯度离心相结合的方法可以得到纯化的骨骼肌卫星细胞;电转染法适用于骨骼肌卫星细胞的基因转染。【结论】建立了胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、纯化、鉴定及基因转染的方法,为通过转基因方法改良秦川牛产肉性能研究奠定了基础。     

大鲵虹彩病毒的分离纯化及其MCP基因序列分析

【目的】确定陕西省略阳县某大鲵养殖场高致死性疾病的病原,分析其主要衣壳蛋白(MCP)的基因特征。【方法】采集患病大鲵,观察其临床症状,取其脏器组织,处理后分别分离细菌和接种鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞,观察细胞病变,分离病毒;对病原进行增殖,采用蔗糖密度梯度(20%,30%,40%,50%,60%)离心法进行纯化,电镜观察纯化样品。克隆分离病毒的MCP基因,测定其序列并进行系统进化树分析。【结果】患病大鲵背部有溃疡、头部胀大且有出血点,尾部有轻微的溃烂。取病鲵内脏组织样品分离病原,未分离到细菌;处理的内脏组织感染EPC细胞,出现细胞病变。电镜观察证实,在蔗糖密度梯度为50%~60%的样品中,病毒粒子的纯度最高,且结构较为完整;病毒粒子的直径约150nm,与虹彩病毒相似。MCPPCR扩增得到了预期长度(1 392bp)的特异性产物。NCBI BLAST结果显示,扩增的MCP序列与蛙病毒属的感染性造血器官坏死病毒(EHNV)、食用蛙病毒(RSV)、普通产婆蟾病毒(CMTV)以及梭鲈虹彩病毒(PPIV)的MCP全长的同源性最高,达到99%;与中华鳖虹彩病毒(STIV)、蛙病毒3型(FV3)、虎纹蛙虹彩病毒(RTV)等MCP全长的同源性为98%。系统发育分析结果显示,导致该例大鲵发病的病毒为蛙病毒属的虹彩病毒。【结论】造成陕西省略阳县某大鲵养殖场大鲵大量死亡的病原为蛙病毒属的虹彩病毒,将该株病毒命名为大鲵虹彩病毒略阳分离株(CGSIV-LY1112)。     

一种改进的对虾白斑综合征病毒提纯方法

对虾白斑综合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白在提纯的过程中易脱落,用传统的密度梯度离心方法不易获得完整的病毒粒子,对传统的蔗糖密度梯度离心方法加以改进后,可以获得大量完整的病毒粒子.用患白斑综合征病毒病的中国对虾鳃制备WSSV粗提液,感染螯虾(Cambarus proclarkii),选取25%的蔗糖溶液用作病虾鳃的匀浆液,然后经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,大量完整的病毒位于46% ～52% 蔗糖梯度之间,病毒粒子末端带有很长的尾;而病毒裸露的核衣壳位于40%～46%蔗糖梯度之间;在57%～62%之间观察到较多完整病毒粒子和少量细菌.实验结果表明改进的病毒提纯方法较好,可得到大量完整的带嚢膜的病毒颗粒.     

用于蛋白质组分析的两种马铃薯块茎蛋白质提取方法的比较

【目的】进行两种提取方法下马铃薯块茎蛋白质组结果差异分析,并确定最佳马铃薯块茎蛋白质提取方法.【方法】采用酚提取法和三氯乙酸/丙酮沉淀与乙酸铵/甲醇沉淀相结合的两步沉淀法提取马铃薯块茎蛋白质,进行2-DE分离,对差异表达蛋白质进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定.【结果】两步沉淀法提取的马铃薯块茎蛋白质较酚提取法获得蛋白质纯度和浓度及蛋白质点数目均明显增加,双向电泳凝胶图谱分辨率较高.质谱鉴定结果表明,两步沉淀法中鉴定的差异表达蛋白质丰度均显著高于酚提取法,并鉴定到一些新出现的蛋白质包括假定的线粒体NAD依赖的苹果酸脱氢酶、酸性磷酸酶类似物和蛋白酶抑制剂II前体类型B.【结论】提取马铃薯块茎蛋白质时两步沉淀法优于酚提取法.     

肝蛋白提取纯化及应用研究进展

介绍了肝蛋白的主要提取方法,即水溶液提取法、碱提酸沉法、有机溶剂提取法、蔗糖密度梯度离心法、超声波萃取法等;分离纯化方法,即盐析法、低温有机溶剂沉淀法、透析与超滤、凝胶过滤法、亲和层析法、电泳法、离子交换层析法等.同时阐述了肝蛋白的应用及其应用前景.