新疆蜜脆苹果阿太菌果腐病菌(Athelia bombacina)的分离与鉴定

【目的】明确造成新疆维吾尔自治区博尔塔拉自治州双河市贮藏的蜜脆苹果出现褐色病斑的致病菌种类。【方法】选取具有典型症状的果实,通过单孢分离法获得纯化菌株,利用形态学特征并联合分子生物学,明确菌株的分类地位,基于科赫氏法则明确致病菌种类。【结果】为明确引起该病的病原菌,对比形态学特征结合ITS和LSU基因片段联合分析后,确定菌株XJAU-PG-1为阿太菌果腐病菌(Athelia bombacina)。【结论】研究首次报道了阿太菌果腐病菌能够侵染苹果果实。     

黄瓜黑星病菌原生质体制备的条件及再生菌株的致病性

分别利用崩溃酶、溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶酶解黄瓜黑星病菌,进行原生质体的制备试验.结果表明:4种酶均能消化该菌细胞壁,获得一定数量的原生质体;产生原生质体效率最高的是崩溃酶,该酶在浓度为18 mg/mL时产生的原生质体数量最多,最佳酶解时间为2~3 h,最适作用温度为28℃.制备的原生质体可以再生并与原始出发菌株具有相同的致病能力.     

白灵菇原生质体制备与再生的研究

详细研究了酶系统、渗透压稳定剂、酶解温度、酶解时间、pH值、菌龄等因素对白灵菇(Pleurotusnebrodensis)原生质体制备与再生的影响。通过单因素和正交实验确定最适条件为:采用7日龄菌丝,以0.6M甘露醇作为渗透压稳定剂,pH5.8时,在1.5%溶壁酶 0.2%蜗牛酶 0.3%纤维素酶的作用下,32℃水浴酶解2.5～3h,可得到1.7×107/mL原生质体,再用双层混合再生培养基培养,可达到1.3%再生率。     

血红铆钉菇原生质体制备条件优化的研究

采用单因素法与正交试验法对血红铆钉菇原生质体制备的条件进行初步优化,筛选出其原生质体制备的最佳条件组合为:菌龄3 d,酶解时间3 h,渗透压稳定剂0.6mol·L-1 KCI,混合酶的浓度比1.5%溶壁酶 0.5%蜗牛酶,酶解温度34℃.     

黑木耳原生质体制备、再生及单核体荧光鉴定

利用正交试验研究了黑木耳原生质体制备、再生的最佳条件,结果表明,原生质体制备最佳条件是酶解温度31℃、酶浓度1．0％、菌龄5d、酶解时间4h,原生质体再生的最佳条件是酶解温度27℃、酶解时间4h、酶浓度1．5％、菌龄11d。稳渗剂种类对黑木耳原生质体再生率的试验结果表明,采用0．5mol／L蔗糖为稳渗剂,各黑木耳菌株的原生质体再生率最高。HW2号菌株原生质体经核染色其单核化比率最高;在荧光显微镜下观察菌丝核相,单、双核清晰可辨。     

秀珍菇原生质体制备研究

对秀珍菇菌丝原生质体制备条件进行了优化。结果表明:以培养5 d的幼嫩菌丝体为材料,在1.5%溶壁酶+0.5%蜗牛酶混合酶作用下,以0.6 mol/L甘露醇作渗透压稳定剂于pH6.0,30℃酶解3.0 h,原生质体产量达到1.96×10~8个/m L。     

平菇P16原生质体制备条件研究

以平菇P16菌丝体为底物,利用溶壁酶进行原生质体制备,考察菌丝培养条件及酶解因素对原生质体制备的影响,从而确定原生质体制备最佳条件。结果表明:原生质体制备的条件为菌丝培养采用MYP液体培养基培养3 d后更换新鲜的培养基继续培养2 d、国产1.5%溶壁酶30℃酶解4 h,在此条件下原生质体浓度达到10~8个/mL。     

双孢蘑菇同核原生质体育种技术研究：Ⅰ.同核原生质体的分离与鉴定

通过对溶壁酶组成及浓度,渗透压稳定剂、菌丝培养方法等研究,建立了有效的双孢蘑菇原生质体制备与再生系统。采用1.5％Lywallzyme、0.6M KCl为渗透压稳定剂,25℃酶解4小时,原生质体的产量可达到10~7个/ml;纯化后的原生质体在0.6M蔗糖为渗透压稳定剂的PDMA培养基中,25℃恒温培养5～7天,再生率达1%以上,根据原生质体再生菌落出现时间的先后顺序,并以菌落形态特征、菌丝生长速度。羧甲基纤维素酶(Cx酶)活性及子实体形成能力上的差异为鉴定同核体的主要标记,从两种形态类型,不同来源的12个双孢蘑菇菌株中均分离到同核原生质体,同核率为2％～15%,平均为11.75％。     

梨采后阿太菌果腐病菌生物学特性及寄主范围测定

对近年来新发现的梨阿太菌果腐病菌（Athelia bombacina）的生物学特性及寄主范围进行了研究。结果表明,病原菌菌丝生长的最佳条件为PDA培养基,温度25 ℃,pH 7,暗处理有利于菌丝生长,菌丝致死温度为54 ℃,10 min;担孢子最佳萌发温度为20 ℃,pH 6,最佳碳源为葡萄糖,光照对孢子萌发影响不明显,担孢子致死温度为52 ℃,10 min。该菌产孢的培养基配方为燕麦15 g、琼脂15 g、葡萄糖10 g、甘氨酸2 g、CaCO3 0.5 g、NaCl 2 g、水1 000 mL,pH 6。相对湿度95%以上,光暗交替及低温诱导均有利于产孢。离体果实接种的寄主范围测定结果表明,A. bombacina除侵染梨果实外,还可侵染苹果、草莓、樱桃、油桃、杏和枣等果实,但不侵染蓝莓、葡萄、橙和猕猴桃等果实,对山楂、橘和柚果实的侵染能力较弱,且对橘和柚的侵染仅限于果皮,不深入到果肉组织中,A. bombacina对梨、苹果不同品种的致病力差别较大。     

漆酶基因Cglac10的缺失对杧果炭疽病菌无性繁殖和侵染能力的影响

【目的】揭示漆酶基因Cglac10在杧果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)生长及侵染致病过程中的功能。【方法】利用qPCR技术对Cglac10在该菌侵染过程中的表达进行分析,并通过同源重组和PEG介导的原生质体转化法获得敲除突变体ΔCglac10H和回复菌株C-ΔCglac10H。【结果】Cglac10基因在侵染过程中的表达量是侵染前的8.02～13.66倍。回复菌株C-ΔCglac10H的表型与野生型菌株的无显著差异;突变体ΔCglac10H除在菌丝生长速率方面与野生型菌株差异不明显外,菌落颜色变为白色,培养10 d时菌丝中黑色素含量下降了67.33%,产孢量显著下降;在水膜中培养至24 h时,ΔCglac10H才偶见形成附着胞,36 h时的形成率仅为野生型菌株的44.85%;在PDB中培养6 d后,ΔCglac10H的胞内漆酶活性较野生型菌株下降了57.61%;不刺伤时,ΔCglac10H几乎不致病,刺伤接种6 d后,观察到ΔCglac10H的致病力比野生型菌株下降了52.94%。【结论】Cglac10在C. gloeosporioides无性繁殖及侵染致病过程中起着重要作用。     

大杯蕈原生质体菌株筛选的研究

对野生大杯蕈（Ｃｌｉｔｏｃｙｂｅ ｍａｘｉｍａ）原生质体的分离再生及再生菌株的构建进行研究,以纤维素酶、溶壁酶、崩溃酶、β－葡萄糖苷酸酶的去壁效果最好,而新生酶,几丁质酶,蜗牛酶的云壁效果较差。２种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。酶解液在０．１％￣２．０％浓度范围内原生质体释放量随酶解液的浓度升高几乎呈直线上升。酶解３￣５ｈ释放的原生质体最多。酶解液ｐＨ值在５．０￣６．０范围内原生质体的产量较高     

秀珍菇原生质体高效制备与再生研究

为建立秀珍菇原生质体的高效制备体系,以夏秀作为供试菌株,采用正交试验法研究影响秀珍菇原生质体制备和再生的条件,对菌龄等7个单因素、 4个复合因素条件和接种方式进行系统研究。结果显示,秀珍菇菌丝在改良液体PD培养基中摇瓶培养5 d,以0.6 mol·L~(-1)甘露醇为稳渗剂, 2.5%溶壁酶在30℃条件下水浴4 h,得到的原生质体浓度最大,为4.23×107个·mL~(-1)。在TB3再生培养基中采用单层混菌法接种原生质体,其再生率最大,为2.35%。     

腐烂病菌的GFP标记及其在梨叶片组织中的侵染和扩展观察

【目的】明确梨腐烂病菌强、弱致病力菌株在梨树叶片组织中的侵染及扩展情况。【方法】利用农杆菌介导的遗传转化(agrobacterium-mediated transformation technique,ATMT)方法对梨腐烂病菌强、弱致病力菌株进行绿色荧光蛋白(green looresent protein,GFP)标记,并筛选出和野生型菌株比较在生长速度、培养特性以及致病力都没有发生显著变化的阳性转化子菌株;利用荧光显微技术观察其在梨树叶片组织中的侵染和扩展,比较强、弱致病力菌株的侵染差异。【结果】强、弱致病力菌株在叶片上侵染存在差异。菌丝主要在叶片的上表皮扩展,菌丝扩展前端的叶片组织颜色发生变化,形成一段变色带,强致病力菌株侵染形成的变色带较弱致病力菌株形成的变色带宽,强致病力菌株菌丝在叶片组织上的分布较稀疏。【结论】梨腐烂病菌菌丝主要在叶片的上表皮组织扩展;强致病力菌株的侵入能力较强,其在叶片上扩展时菌丝分布较稀疏,扩展前端形成的变色带宽。     

杧果蒂腐可可球二孢菌致病力测定及杧果主要品种抗病性评价

【目的】测定杧果蒂腐病可可球二孢(B.theobromae)不同菌株的致病力及评价杧果品种的抗病性,为杧果蒂腐病防治技术的研究奠定基础。【方法】采用室内人工接种的方法,对124个B.theobromae菌株进行致病力测定,并针对11个杧果品种进行抗病初步测定。【结果】B.theobromae菌株之间致病力有较大差异,强致病力菌株占28.23%,中等致病力菌株占66.93%,弱致病力菌株占4.84%。同一品种资源分别接种5个不同菌株,抗病性存在较大差异;但是,通过接种B.theobromae后的平均病情指数进行抗性分级,对多个菌株的抗病性进行综合评价发现,‘象牙’为高感(HS)材料,而其余10份材料均表现为感病(S)。【结论】杧果可可球二孢是引起杧果蒂腐的优势病原菌,强致病力和中等致病力菌株在海南分布广泛;供试11份杧果材料中没有对B.theobromae菌株表现抗病的杧果品种。     

灵芝原生质体制备与再生条件的研究

本文研究了不同酶浓度、酶解温度、酶解时间、渗透压稳定剂及菌龄等对灵芝菌丝原生质体制备与再生的影响，结果表明，菌龄为60h的菌丝，采用浓度为2％的溶壁酶以0．6M的甘露醇作渗透压稳定剂于pH6.5，30℃下酶解2h，当酶解液中湿菌体含量对0．1g/mL时，其原生质体数可达2^*10^7个/mL，且再生率达8．5％。     

凤尾菇菌丝原生质体的分离与再生

本文利用一种自制的真菌细胞壁溶解酶——溶壁酶(Lywallzyme),通过酶解试验比较了菌龄、渗透压稳定剂、酶解温度及酶解时间等对凤尾菇菌丝原生质体分离的影响。通过原生质体的再生试验,系统地比较了菌龄、渗透压稳定剂和酶解时间及再生培养基对凤尾菇菌丝原生质体再生频率的影响,从而找到凤尾菇茵丝原生质体分离和再生的较适条件。在适宜的酶解条件下可分离到大量有活力的原生质体,其产量最高可达3×10~7个/me以上。本试验中,原生质体的再生频率最高为4.98％。同时,本文还对凤尾菇菌丝原生质体再生过程的形态变化作了适当描述。     

硫磺菌原生质体的制备

试验分析了酶浓度、菌龄、渗透压稳定剂以及酶解温度和时间等因素对硫磺菌原生质体产出量的影响。结果表明：采用液体发酵培养第5天的菌丝体,以0．6mol／L KCl作渗透压稳定剂,加入1．5g/L混合酶（即纤维素酶与蜗牛酶按1：1混合）在30℃下酶解3．5h,制备原生质体效果最佳,原生质体产出量可达8．9×10^7个／mL。     

猴头菌融合育种原生质体制备与再生条件优化

以猴头菌0605为试材,采用单因素试验和正交实验,研究了酶系统、酶解时间、酶解温度、菌龄、恒温摇床转速单因素对其原生质体制备与再生的影响。结果表明:原生质体制备和再生的最佳条件为菌龄10 d的菌丝体,在酶系统2.0%溶壁酶+0.5%崩溃酶作用下,32℃酶解2.5 h,恒温摇床转速为120 r·min-1。该试验在最佳条件下获得的猴头菌原生质体数量与再生率均较高,为进一步开展猴头菌原生质体融合育种奠定基础。     

银耳菌丝原生质体分离和再生研究

以菌株Tr01为材料，研究了不同菌龄、溶壁酶浓度、酶解温度、稳渗剂对银耳工力丝在的原生质体产量及不同稳渗剂对原生质再生的影响。结果表明，原生质体分离的最佳条件为：菌丝菌龄9天，酶液浓度2％，稳渗剂0.4mol/L硫酸镁，在34℃下酶解4h，原生质体以0.4mol/L甘露醇作稳渗剂再生率较高，为1.13%。     

姬松茸原生质体制备及再生条件优化

以姬松茸JS01为试材,通过单因素试验和正交实验,利用SPSS 22.0软件进行分析,对姬松茸原生质体的制备及再生条件进行优化,以提高姬松茸原生质体产量和再生率。首次通过在再生培养基中添加细胞壁前体物质及营养因子,进一步提高姬松茸原生质体的再生率。结果表明:原生质体最佳制备条件为菌龄7d,以0.6mol·L~(-1) KCl作渗透压稳定剂,溶壁酶浓度1.5%,酶解温度30℃,酶解时间4.0h,pH 6.0,在该条件下原生质体产量高达1.97×10~7个·mL~(-1);菌龄6d,以0.6mol·L~(-1) MgSO_4作渗透压稳定剂,溶壁酶浓度2.0%,酶解温度30℃,酶解时间3.0h,pH 6.5,再生培养基为GM时,原生质体的再生率最高,为1.12%。再生培养基中添加纤维二糖和维生素B_1后,再生率为1.17%,较优化结果提高了4.46%。该研究为姬松茸在菌种提纯复壮、原生质体诱变、原生质体融合育种、原生质体基因组重排等遗传学研究提供参考依据。