人参实时荧光定量PCR鉴定方法的建立

根据人参和人参属其他物种的18S rRNA基因序列差异设计特异引物和探针,建立人参TaqMan实时荧光PCR鉴定方法.应用该方法测试58个样品,包括30个不同来源的人参样品、 15个其他人参属样品以及13个形态近似样品.结果表明：所有供试的人参样品均表现为阳性扩增,非人参及空白对照均未出现阳性扩增.灵敏度检测结果显示：此实时荧光PCR方法的最低检测限为0.03 pg/μL反应.此方法可快速、准确、灵敏地鉴定人参及其加工产品,适用于口岸进出口鉴定.     

实时荧光定量PCR定量方法研究进展

实时荧光定量PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,综述了实时荧光定量PCR技术及其定量方法的研究进展,并展望了其应用前景。     

实时荧光定量PCR鉴定小麦矮腥黑穗菌技术研究

 【目的】建立荧光定量PCR体系以准确灵敏的鉴定小麦黑穗菌(Tilletia controversa Kühn,TCK)【方法】根据筛选的TCK独有差异基因片段（1 322 bp）设计特异性引物对CQUTCK4/CQUTCK5和TaqMan 探针CQUP1,建立SYBR GreenⅠ荧光染料法和TaqMan水解探针法定量PCR检测体系,并对体系进行优化。【结果】建立的两套定量PCR检测体系的检测下限相当,可达到0.1fg,对应的拷贝数为2.31×104个,检测灵敏度比常规PCR高2～3个数量级,均可成功鉴别出TCK与小麦网腥黑穗病菌(Tilletia caries (DC)Tul,TCT),并可快速准确检测小麦矮腥黑穗菌冬孢子和检测罹病小麦植株体内的侵染菌丝体。【结论】建立的2种定量PCR检测技术可运用于小麦矮腥黑穗病的早期诊断。     

实时荧光定量PCR应用技术综述

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的一种高灵敏度的核酸定量技术。使用EB加入PCR反应体系,经改装的带有CCD的PCR仪检测样品的荧光强度,其优势性决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法,而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。与传统PCR技术相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行实时定量检测。     

实时荧光定量PCR反应体系的优化研究

为了降低实时荧光定量PCR(Real-Time Fluorescent Quantitative PCR,FQ-PCR)技术的实验成本,提高利用效率,对影响FQ-PCR较敏感的因素二甲基亚砜(DMSO)、甘油和Mg2+等进行了优化试验.结果表明,10μL反应体系的最优组分为:1×rTaqBuffer,0.16 mmol/L dNTPs,0.24μmol/L Primer,2.5 mmol/L Mg2+,5％甘油,5％ DMSO,1×SYBR Green I,0.8 U rTaq酶,100 ng模板.该反应体系为经济型FQ-PCR的广泛应用奠定了基础.     

实时荧光定量PCR技术在番茄研究中的应用

随着实时荧光定量PCR技术的不断完善和发展,该技术越来越受到人们的青睐。它以快速、灵敏、高特异性和安全性高等优点广泛应用于科学研究等各个领域。近年来,实时荧光定量PCR技术在番茄的各研究领域不断深入,大大提高了番茄的病害检测能力、特异基因的表达水平和转基因的检测效率。     

实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合症病毒方法的建立

[目的]根据对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）的保守序列,利用Primer5.0软件设计引物,建立了WSSV的荧光实时定量PCR检测体系。[方法]构建含有WSSV目扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,探索反应条件。[结果]确定了最佳退火温度（61℃）和最佳引物浓度（0.2μmol/L）,标准品浓度在8.8×1098.8×104个拷贝数之间有典型的＂s＂型扩增曲线,标准曲线中模板拷贝数（X）与Ct值的关系为Ct=-3.597lgX＋42.547,相关系数R2=0.993。[结论]该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）、肝胰腺细小病毒（HPV）没有扩增反应。     

实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效,高通量,而且高敏感性等特点,该技术在分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等方面有广泛的应用。文章对实时荧光定量PCR的原理、影响因素以及在植物病害和遗传育种方面的应用等进行了综述。     

实时荧光定量PCR技术及其在植物中的应用

阐述了实时荧光定量PCR技术的基本原理及方法,综述了近几年实时荧光定量PCR技术在转基因植物、植物病害及与植物表皮气孔变化相关激酶检测过程中的运用情况;展望了实时荧光定量PCR反应在植物核酸定性、定量检测及分析其在植物中的应用前景。     

实时荧光定量PCR技术的应用

1985年Mullis等发明了聚合酶链反应（PCR）技术，成为20世纪生物医学领域革命性创举，使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。1992年，Higuchi最早提出了实时PCR的设想。     

绵羊肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立

为研究绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,Mo）侵害山羊的组织嗜性、筛选其最佳培养基及建立快速检测方法,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,以Mo Y98株16S rRNA基因重组质粒pMD19 MoFQ为模板,通过优化反应体系构建标准曲线,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因的FQ PCR方法,并对所建方法进行重复性、特异性、敏感性及应用性检测。结果表明,所建Mo 16S rRNA基因检测FQ PCR方法具有较好的重复性、特异性、临床应用性,Mo核酸拷贝最低检出量可至10 μL^-1。该方法不仅可作为Mo临床检测方法,且为后续Mo研究工作提供技术支持。     

采用实时荧光定量PCR技术比较提取土壤真菌DNA方法的差异

[目的]采用实时荧光定量PCR技术比较手提方式和OMEGA微量土壤DNA提取试剂盒获得土壤中真菌DNA的差异。[方法]接种5个梯度稀释的辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）菌丝到灭菌土壤中,并设置不接种的样品为阴性对照。采用手提方式和OMEGA土壤微量DNA提取试剂盒分别提取制备的土壤样品,采用实时荧光定量PCR方法和辣椒疫霉菌的特异性引物对土壤样品中的辣椒疫霉菌进行定量,并对结果进行比较,分析两种方法的特点。[结果]手提方式和试剂盒方式获得的土壤真菌DNA受土壤中杂质的影响较小,并且均能获得适合实时荧光定量PCR技术的模板DNA。采用试剂盒方式获得的辣椒疫霉菌定量结果比手工提取方式获得的辣椒疫霉菌定量结果平均高2.78倍。[结论]采用OMEGA微量土壤DNA提取试剂盒方法获得的菌体基因组DNA的量较多,定量结果更精确;手提方法所需试剂均为常用生化试剂,方便获得且价格低廉。因此,两种方法各有优势,可以根据实际情况选择。     

鹿茸及鹿血中布鲁氏菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立可应用于快速检测鹿茸及鹿血中布鲁氏菌的方法,保证鹿产品的药用、食用安全,试验根据布鲁氏菌特异性基因IS711设计合成引物和探针,建立实时荧光定量PCR方法,对反应条件进行优化,并绘制标准动力学曲线,Y=-3.14X+37.62,R2=0.997.结果 表明:该方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,组内、组间重复性...     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉历基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法.[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针.然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线.[结果j抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X 43.783 512,相关系数R2为0.997 867.[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点.     

实时荧光定量PCR法检测抗虫棉Bt基因拷贝数方法的建立

[目的]建立并完善Taqman实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法。[方法]通过Bt基因序列,利用软件Primer5.0设计引物和探针,然后利用10倍系列稀释含有目的基因的质粒pG4AB,进行实时荧光定量PCR反应,制作标准曲线。[结果]抗虫基因拷贝数与Ct值的关系为Ct=-3.549 632X+43.783 512,相关系数R2为0.997 867。[结论]实时荧光定量PCR检测转基因抗虫棉Bt基因的方法具有特异性好、灵敏度高的特点。     

芜菁实时荧光定量PCR内参基因筛选

为筛选适宜芜菁(Brassica rapa L.ssp.rapa)基因表达分析的内参基因,在ICG(http://icg.big.ac.cn/index.php/Main_Page)中以十字花科作物为参照选择10个候选内参基因。实时荧光定量PCR结果显示ACT、TIP41、Tub-a、UBC30、CyP、UBC21 6个内参基因重复性较好,均能特异扩增并有较高的扩增效率,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对内参基因在不同组织中的表达稳定性进行分析,为芜菁基因差异表达研究提供可靠的内参基因,以确保分析结果的可靠性。结果表明,ACT、Tub-a和CyP的M值大于geNorm程序的默认值1.5,稳定性相对较差,6个候选内参基因的表达稳定性排序为:UBC21=TIP41UBC30ACTTub-aCyP,所以,UBC21和TIP41是最稳定的组合。NormFinder的分析结果显示稳定性排序为TIP41ACTTub-aUBC30UBC21CyP,TIP41为最优内参基因,与geNorm分析结果一致,BestKeeper分析结果同geNorm和NormFinder的结果一致。通过RefFinder软件综合分析得出TIP41和UBC21为芜菁不同组织基因表达分析比较理想的内参基因,本研究首次评价了芜菁内参基因的稳定性,为该物种基因表达分析提供了参考。     

实时荧光定量PCR技术在植物检疫中应用的研究进展

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,具有操作简便、快速高效、高通量、高敏感性等特点。近年来,实时荧光定量PCR技术在植物检疫研究上不断深入,大大提高了植物疫情的检测效率和监测防治水平。综合论述了实时荧光定量PCR技术在由真菌、细菌、病毒和线虫引发的植物疫情的检测与应用。     

实时荧光定量PCR在动物疫病中的应用

综述了实时荧光定量PCR在诊断动物病毒病、细菌病和寄生虫病中的应用。     

实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgM mRNA方法的建立

建立了SYBR greenⅡ实时荧光定量PCR检测鲫鱼IgMmRNA水平的方法,即构建鲫鱼IgM标准品质粒,10倍稀释质粒标准品,建立标准曲线,进行熔解曲线分析和稳定性分析。结果表明,Ct值线性范围为5.8～25.4,相关系数为1;熔解曲线峰值单一,Tm为85.62(±0.13)℃;组内变异系数CV为0.18%～1.07%,组间变异系数为0.31%～2.31%。该方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。     

五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为五倍子蜂蜜的鉴定检测提供技术支撑,利用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,以五倍子树基因组中ITS基因为靶序列,设计并筛选出特异性引物探针,通过特异性、灵敏度和重复性等试验,建立五倍子蜂蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法。结果表明:建立的方法特异性良好,生成的标准曲线有良好的线性关系,相关系数(R2)为0.998,最低检测限为0.2pg DNA/反应。该方法特异性强、灵敏度高、结果可靠。