甘蔗易化子家族蛋白Sc ZIFL1与6K2互作应答SCMV侵染

易化子超家族转运蛋白(major facilitator superfamily,MFS)在生物中普遍存在,锌诱导类辅助因子(zinc induced facilitator like,ZIFL)是MFS成员,参与小分子有机物运输。本课题组前期利用酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2H)技术从甘蔗(Saccharum spp.hybrid)中分离鉴定了1个与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)编码蛋白6K2互作的ZIFL,命名为Sc ZIFL1。本研究利用双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation,Bi FC)进一步验证了Sc ZIFL1与SCMV-6K2的互作。生物信息学分析表明,Sc ZIFL1长度为484个氨基酸,无信号肽,具有12个跨膜结构域,为不稳定的疏水性蛋白。序列比对分析表明,Sc ZIFL1具有MFS保守的半胱氨酸模体、特征基序及反向运输基序。系统进化树分析表明,该蛋白在单子叶和双子叶植物之间,以及单子叶C3植物和C4植物之间存在明显分化。亚细胞定位试验表明,Sc ...     

甘蔗ScCRT1基因克隆及其应答SCMV侵染分子机制的研究

钙网蛋白(calreticulin,CRT)在真核生物中广泛表达,是重要的分子伴侣和钙离子结合蛋白,参与调控Ca2+稳态、钙依赖信号、内质网质量控制、植物生长发育、免疫反应和逆境应答等多种生物学过程。甘蔗(Saccharum spp.hybrid)中CRT应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)侵染尚未见报道。本研究从热带种Badila(S.officinarum)中克隆了1个CRT1/CRT2亚型的CRT编码基因,命名为ScCRT1。该基因开放读码框(open reading frame,ORF)长度为1281bp,编码长度为426aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScCRT1具有典型的CRT蛋白结构域,为稳定的亲水性蛋白,其N端有一个信号肽,具有典型的跨膜结构域,C端有典型的内质网定位信号;二级结构多为无规则卷曲;系统进化树分析表明,该蛋白是典型的CRT蛋白,在单子叶和双子叶植物中具有明显的分化。亚细胞定位表明ScCRT1定位于内质网。实时荧光定量PCR分析发现,ScCRT1基因在甘蔗各组织中都有表达,在第8节间中的表达量最低,在心叶中的表达量较高;该基因在SCMV侵染早期表达量上调,后期下调表达。酵母双杂交(yeast two hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验表明,ScCRT1与SCMV-6K2蛋白互作。推测SCMV-6K2通过与ScCRT1互作调控钙离子稳态进而便于SCMV侵染。     

甘蔗PsbR亚基应答SCMV侵染及其与SCMV-6K2的互作

光系统II (Photosystem II, PSII)的PsbR亚基对于放氧复合体(oxygen-evolving complex)的组装和稳定具有至关重要的作用。本课题组前期克隆了甘蔗(Saccharum spp. hybrid)的PsbR亚基编码基因,命名为ScPsbR,并利用酵母双杂交技术(yeast two hybrid, Y2H)验证了ScPsbR与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)编码蛋白6K2的互作。本研究通过生物信息学分析表明,ScPsbR具有典型的PsbR亚基结构域,无信号肽,具有1个跨膜结构域,为稳定的疏水性蛋白。系统进化树分析表明,该蛋白在C3和C4植物中存在明显的分化。亚细胞定位试验表明, ScPsbR定位于叶绿体且与SCMV-6K2共定位。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)试验进一步验证了ScPsbR与SCMV-6K2的互作。实时荧光定量PCR检测表明,ScPsbR基因表达具有显著的组织特异性,在根和茎中表达极少,未成熟叶片和初衰叶中次之,成熟叶片中相对表达量最高;SCMV侵染显著影响ScPsbR基因表达,ScPsbR基因在侵染0～12 h显著上调,侵染1～5 d下调至略低于对照的水平,但差异不显著,侵染7～15 d显著下调。     

甘蔗CDK基因的cDNA全长克隆与表达分析

植物细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,与周期蛋白(Cyclins)协同作用,是重要的细胞周期性调控因子。本研究从甘蔗受花叶病毒侵染的转录组数据库中获得一条与高粱(Sorghum bicolor)CDK基因(Gen Bank登录号为XP_002466536.1)高度同源的Unigene序列,通过RT-PCR扩增获得长度为1799 bp的甘蔗Sc CDK基因(Gen Bank登录号为KR258796)。序列分析显示Sc CDK基因含一个完整的开放阅读框(65~1603 bp),编码512个氨基酸,且具有CDK典型保守结构域,如ATP结合位点、磷酸结合位点及活化环A-loop。此外,生物信息学预测显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与蛋白翻译。实时荧光定量PCR分析表明,Sc CDK基因的表达具有组织特异性,其在蔗芽上的表达量最高,其次是在蔗肉、蔗根、叶鞘和蔗皮中;在PEG、Na Cl和ABA的胁迫诱导过程中,Sc CDK均表现上调作用,且受ABA胁迫后表达量最高,约为对照组的1.9倍。推测该基因的表达与甘蔗抗干旱和抗渗透胁迫有关,同时受ABA的诱导,参与细胞周期分裂。     

甘蔗ScPR10基因的克隆及其响应赤条病菌侵染的表达特征分析

PR10是一种病程相关蛋白(pathogenesis-relatedprotein,PR),在植物生长发育、应激生物和非生物胁迫时发挥重要作用。本研究利用RT-PCR技术从甘蔗赤条病抗病品种新台糖22号和感病品种闽糖11-610叶片克隆获得Sc PR10基因,并利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)、转录组和蛋白质组分析,研究在接种燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp. avenae, Aaa)之后这2个品种Sc PR10基因的转录和蛋白表达模式。序列分析显示,本研究克隆获得2个Sc PR10基因,编码187个氨基酸,比其他植物PR10蛋白多了27个氨基酸,含有保守结构域P-loop和Betv1;与已报道的甘蔗、高粱和斑茅的PR10亲缘关系较近。在Aaa胁迫下,RT-q PCR分析表明抗病、感病品种Sc PR10基因的表达量均显著上调,尤其在接种24 h时,表达量最高,分别为对照的27.2倍和39.7倍;转录组数据分析结果显示,该基因表达水平在抗病、感病品种上均显著提高,尤其在接种72h时,表达量最高,log2FC值为5.3～5.4。蛋白互作预测发现,...     

甘蔗NAD(P)H脱氢酶复合体O亚基基因克隆及其与甘蔗花叶病毒VPg互作

NAD(P)H脱氢酶(NDH)复合体介导循环电子传递,对于维持叶绿体高效的光合作用具有重要作用。甘蔗(Saccharum spp. hybrid)中NDH复合体应答及参与甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)的侵染尚未见报道。本研究克隆了甘蔗NDH复合体的O亚基,命名为ScNdhO,其开放读码框(open reading frame, ORF)长度为471 bp,编码长度为156 aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScNdhO为稳定的亲水性蛋白,不存在信号肽,无跨膜结构域;蛋白二级结构元件多为无规则卷曲,具有典型的NDH复合体O亚基结构域;系统进化树分析表明,该蛋白属于NDH复合体O亚基蛋白家族。实时荧光定量PCR分析发现,ScNdhO基因的表达具有明显的组织特异性,在成熟甘蔗叶片中的表达量最高,在茎中的表达量最低,在根中几乎不表达;ScNdhO基因在SCMV侵染早期上调表达,后期下调表达。亚细胞定位分析表明, ScNdhO定位于叶绿体。酵母双杂交(yeast two hybrid, Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescencecomplementation,BiFC)实验表明,ScNdhO与SCMV-VPg互作。推测ScNdhO被SCMV选择性利用,可能参与SCMV基因组复制及花叶病症状的产生。     

甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因家族的鉴定、定位和表达分析

独脚金内酯(strigolactones, SLs)是一种广泛存在、能够抑制植物分蘖或分枝的植物激素。β-胡萝卜素异构酶(D27)是SLs合成中的关键酶,但是目前关于甘蔗D27基因家族的鉴定与分析鲜有报道。本研究通过挖掘甘蔗原始亲本之一的割手密种基因组数据鉴定了5个割手密种D27基因家族成员。系统进化树分析发现,割手密种D27s分处在3个不同系统发育分支,与高粱D27s高度同源。保守结构域预测揭示,割手密种D27s包含β-胡萝卜素异构酶的典型结构域Pfam:DUF4033。顺式元件分析结果显示,割手密种D27s主要参与调控激素和胁迫响应,以及植物生长发育等。基于甘蔗栽培种转录组数据分析发现,甘蔗割手密种D27基因家族成员(Sspon.06G0012830-1A)的同源基因同时参与甘蔗分蘖调控及黑穗病菌胁迫响应。在此基础上,我们克隆获得了甘蔗栽培种ROC22中的同源基因cDNA序列,命名为ScD27.1 (GenBank登录号为MT499895)。生物信息学分析结果显示, ScD27.1编码266个氨基酸,其蛋白等电点为8.91,分子量为30.00 kD,是不稳定蛋白且定位于叶绿体。二级结构主要包括α-螺旋和无规则卷曲,具有叶绿体转运肽,包含4个泛素化位点和18个磷酸化位点。qRT-PCR表达分析表明,ScD27.1基因受ABA及H2O2显著诱导表达,但对MeJA、SA胁迫响应不明显。亚细胞定位结果显示, ScD27.1蛋白可能定位于细胞膜和叶绿体,参与细胞内膜泡运输或由液泡前体、胞内运输小泡分拣运输。以上研究表明, ScD27.1基因可能参与黑穗病菌侵染诱导的甘蔗分蘖及ABA和H2O2相关信号通路。本研究为了解甘蔗ScD27.1蛋白在胞内运输和分蘖中的作用及其参与甘蔗-黑穗病菌互作提供一定的基础理论。     

甘蔗VAMP相关蛋白ScPVA12与甘蔗花叶病毒P3N-PIPO的互作研究

植物囊泡膜蛋白相关蛋白PVA12 (plant vesicle-associated membrane protein (VAMP)-associated proteins homolog12)属于VAP27家族蛋白,在细胞中介导内质网囊泡运输以及膜融合。甘蔗(Saccharumspp.hybrid)PVA12应答甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)侵染尚未见报道。本研究从栽培种新台糖22号(ROC22)中克隆了PVA12基因,命名为ScPVA12。该基因开放读码框(open reading frame, ORF)的长度为735 bp,其编码长度为244 aa的蛋白。生物信息学分析表明,ScPVA12是一种不稳定的亲水性脂溶蛋白,C端具有跨膜结构域;二级结构中无规则卷曲占比最高;进化树分析表明,该蛋白在单子叶和双子叶植物中存在明显分化。酵母双杂交(yeast two-hybrid, Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)试验表明, ScPVA12与SCMV-P3N-PI...     

甘蔗ScCRT1基因克隆及其应答SCMV侵染分子机制的研究

Calreticulin (CRT) is widely expressed in eukaryotes. As a molecular chaperone and a Ca²⁺ binding protein, CRT is involved in many biological pathways such as the regulation of calcium homeostasis, calcium-dependent signaling, endoplasmic reticulum quality control, plant growth and development, immunity and response to stress. However, the response of CRT of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) challenged by Sugarcane mosaic virus (SCMV) has not been reported. In this study, a CRT gene was cloned from the noble cane cultivar Badila (S. officinarum) and designed as ScCRT1. ScCRT1 had an open reading frame (ORF) length of 1281 bp and encoded 426 amino acids. Bioinformatics analysis showed that ScCRT1 was a stable hydrophilic protein and possesses a signal peptide at the N-terminal, a typical transmembrane domain, and a typical endoplasmic reticulum location signal at the C-terminal. The secondary structure of ScCRT1 was composed of mostly random coils. Phylogenetic tree analysis indicated that ScCRT1 belonged to the CRT1/CRT2 subtype and was divergent between monocotyledons and dicotyledons. Subcellular location assays showed that ScCRT1 was mainly located in the endoplasmic reticulum. Real-time quantitative PCR analysis showed that ScCRT1 gene was extensively expressed in different tissues of sugarcane, with the highest expression in leaf roll and the lowest expression in the 8th internode. ScCRT1 gene was up regulated in the early stage of SCMV infection, but down regulated with time going. ScCRT1 interacted with the 6K2 from SCMV as confirmed by yeast two hybrid and bimolecular fluorescence complementation assays. Based on these foundlings, we speculated SCMV interfered the calcium homeostasis by the interaction of 6K2 with ScCRT1, thereby facilitating viral infection of sugarcane.     

甘蔗PsbS亚基应答甘蔗花叶病毒侵染及其与6K2蛋白的互作研究

Non-photochemical quenching (NPQ) is the main mechanism of photoprotective regulation in higher plants. The PsbS subunit of Photosystem II (PSII) plays a key role in NPQ. The involvement of PSII PsbS subunit in Sugarcane mosaic virus (SCMV) infection of sugarcane (Saccharum spp. hybrid) has not been reported. In the previous research, we cloned the coding sequence of the PsbS subunit from sugarcane and designated it as ScPsbS. ScPsbS had an open reading frame (ORF) length of 798 bp and encoded a protein of 265 aa. Bioinformatics analysis showed that ScPsbS was a stable hydrophobic protein with chloroplast localization signals and four transmembrane domains. The ScPsbS protein possesses a typical domain of PsbS protein. Phylogenetic tree analysis showed that ScPsbS was divergent between monocotyledons and dicotyledons, or C₃ plants and C₄ plants. Subcellular localization analysis showed that ScPsbS was located in chloroplasts and partially colocalized with SCMV-6k2 in chloroplasts. The interaction of ScPsbS with the SCMV-6K2 was further confirmed by bimolecular fluorescence complementation assays (BiFC). ScPsbS gene showed obvious tissue specificity in sugarcane tested by real-time quantitative PCR analysis. ScPsbS gene had highest expression in mature leaves, followed by immature leaves and leaves beginning to senesce, and hardly expressed in stems and roots. The expression of ScPsbS gene was significantly affected by SCMV infection, with significant upregulation in the early stage of SCMV infection, and no significant affection in the later stage of SCMV infection.     

复合侵染甘蔗的病原病毒RT-PCR检测

根据甘蔗花叶病毒（sugarcane mosaic virus,SCMV）、高粱花叶病毒（sorghum mosaic virus,SrMV）和甘蔗黄叶病毒（sugarcane yellow leaf virus,SCYLV）外壳蛋白（CP）基因序列分别设计合成3对特异引物SCMV–F/R、SrMV-F/R和SCYLV-F/R,以表现花叶和黄叶复合症状的甘蔗叶片总RNA为模板,分别进行3种病毒单一RT-PCR检测,在SrMV和SCYLV特异引物RT-PCR反应体系中分别扩增到约850 bp和630 bp特异性片段。序列测定及同源性比对结果显示,850 bp片段测序所得序列与浙江象山、临平和余杭SrMV分离物（GenBank登录号分别为AJ310194、AJ310195和AJ310198）对应序列同源性95%,630 bp片段测序所得序列与广东、广西、福建SCYLV分离物（GenBank登录号分别为GU190165、GU190162、GU190159）对应序列同源性99%,表明该样品同时感染SrMV和SCYLV。在此基础上建立同时检测SrMV和SCYLV的一步双重RT-PCR体系,可检测10-6 g病叶组织中的病毒,田间样品检测效果良好。     

玉米抗甘蔗花叶病毒资源的遗传多样性研究

利用人工接毒方法对46份我国主要玉米自交系进行了两年抗甘蔗花叶病毒鉴定,筛选出高抗系8份(K22、CN962、P138、齐318、中自01、金黄96B、齐319、Pa405),抗病系7份(旱21、中自03、旱23、农大178、获白、K12、黄早四).用SSR标记研究了46份自交系的遗传多样性.49对引物共检测出168个等位基因变异,每对引物检测等位基因2～10个,     

果蔗健康种苗田间效果评价

甘蔗宿根矮化病(ratoon stunting disease,RSD)和花叶病(sugarcane mosaic disease,SMD)是引起果蔗种性退化的主要原因,其有效的防治方法是种植果蔗健康种苗。为评价果蔗健康种苗的田间效果,笔者进行果蔗健康种苗与其普通种茎苗新植田间比较试验,并应用分子检测技术对种苗甘蔗宿根矮化病菌和甘蔗花叶病病原病毒（甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒及甘蔗线条花叶病毒）进行检测。结果表明,果蔗健康种苗较其普通种茎苗蔗茎产量增产23.85%,甘蔗蔗糖分提高0.36个百分点;茎长增长20.6 cm、节间增长2.47 cm、单茎重增重0.65 kg;萌芽快,萌芽率提高24.6个百分点,分蘖率提高18.4个百分点,但两者的有效茎数差异不明显。健康种苗未检测出甘蔗宿根矮化病菌及甘蔗花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗线条花叶病毒。研究表明,果蔗健康种苗具有显著的增产提质效果。     

种植行向对玉米茎叶形态建成与产量的调控效应

以玉米品种郑单958为材料,2012–2013年采用田间不同行向种植设计,研究了种植行向对玉米茎叶形态建成和产量的调控。结果表明,种植行向对玉米叶和茎的形态建成影响显著。与南北行向(N-S)相比,东西行向(E-W)显著促进了中上部叶片(第11~第17叶)的伸长,增加了叶面积,但对叶宽影响不显著。种植行向显著影响了玉米茎秆质量,E-W种植方式显著促进了植株中下部节间的伸长和增粗,增加了第9和第10节间单位长度干重和茎秆折断强度。种植行向对拔节期植株干重没有显著影响,但E-W种植方式在大口期至成熟期的单株总生物量积累显著高于N-S种植,同时促进了干物质由叶、茎向雌穗的转移,显著提高了收获指数。E-W种植方式显著增加了玉米千粒重,提高了产量。因此,华北地区E-W种植方式可显著促进玉米茎叶生长和植株干物质积累,增加粒重,提高收获指数,提高产量。     

甘蔗Rieske Fe/S蛋白前体基因ScPetC的克隆及表达分析

细胞色素b6f复合体还原型铁硫蛋白前体(Cytochrome b6f complex Rieske Fe/S precursor protein, PetC)是由细胞核PetC基因编码的蛋白,其成熟蛋白参与构成细胞色素b6f复合体,是电子传递的重要元件。基于前期构建的受高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)侵染的甘蔗转录组数据库,从主栽甘蔗品种‘新台糖22号’叶片中成功克隆到该基因,并命名为ScPetC (GenBank登录号为MH333037.1)。生物信息学分析发现, ScPetC基因cDNA全长824bp,包含了一个678bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。ScPetC属于PRK13473超家族,其C末端具有典型的Rieske保守结构域;蛋白理论等电点为8.19,属于稳定的、亲水性蛋白;二级结构多为无规则卷曲,三级结构预测其比其他植物PetC多出一段α螺旋结构。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScPetC定位于叶绿体、细胞质和细胞膜。尽管前人研究表明, ScPetC的表达量会受SrMV侵染的影响,不同于半夏(Pinellia ternata) PetC与大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV) P1蛋白之间的互作, ScPetC不能与SrMV-P1蛋白互作,但能与甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus, SCYLV) P0蛋白互作。实时荧光定量PCR分析表明, ScPetC基因在甘蔗不同组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高。甘蔗受脱落酸胁迫3 h时, ScPetC表达量显著上调,但是随着处理时间的延长,表达受到抑制;在茉莉酸甲酯、水杨酸、氯化铜、氯化镉和氯化钠胁迫下,ScPetC表达量均显著下调。本研究通过对ScPetC生物学功能、环境外源激素与重金属等胁迫下的表达模式及其与甘蔗病原病毒蛋白互作的初步探究,增加了对甘蔗PetC的了解,也为深入研究其在甘蔗受黄叶病毒侵染中的作用奠定基础。     

抗甘蔗花叶病毒的无标记反向重复转基因玉米

构建了无标记基因的源自玉米矮花叶病的主要病原——甘蔗花叶病毒(sugarcane mosaic virus, SCMV)复制酶基因的反向重复序列表达载体,通过农杆菌介导法以该表达载体和除草剂标记基因表达载体共转化玉米自交系综3的幼胚,用除草剂梯度筛选,获得了可育的再生株。对T₁和T₂代群体作PCR和DNA点杂交,结合温室和田间人工接种病毒进行抗病性鉴定,获得了比较稳定的对SCMV高抗的无标记转基因玉米株系。