两种检测猪瘟和猪伪狂犬病毒抗体方法比较

为评价Wellray CSFV和PRV抗体快速检测方法在临床样品检测中的适用性,将其与IDEXX公司ELISA抗体检测方法进行比较试验。试验对177份血清进行CSFV抗体、 PRV gB和PRV gE抗体的对比检测。结果显示, Wellray CSFV抗体快速检测方法与IDEXX公司ELISA抗体检测方法的符合率、相对敏感性、相对特异性分别为87.72%、 96%、 81.25%,Kappa值=0.756, PRVgB抗体分别为92.06%、 91.67%、 92.59%, Kappa值=0.839, PRVgE抗体分别为84.21%、 85.71%、83.33%, Kappa值=0.671。结果表明, Wellray CSFV和PRV抗体快速检测方法与IDEXX公司ELISA抗体检测方法的符合率、相对敏感性、相对特异性都较高,且不需要昂贵复杂的仪器设备, 15min内即可完成检测,能更好地适应基层检测的实际需求。     

2种猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测试剂盒的比较分析

选取2种猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测试剂盒进行符合率、敏感性(D_se)、特异性(D_sp)、批内重复性(Re)比较分析，以期了解国产试剂盒与进口试剂盒在试验结果上的差异性。结果显示：通过对45份临床样品进行检测发现金诺试剂盒检测敏感性(D_se)为84%,检测特异性(D_sp)为100%,2种试剂盒总符合率为91.11%。该研究结果为实验室检测猪繁殖与呼吸综合征抗体提供了试剂盒选用参考。     

两种检测猪伪狂犬病gB抗体方法比较

为评价化学发光免疫分析法在临床检测猪伪狂犬病gB抗体中的适用性,将其与IDEXX公司ELISA抗体检测方法进行比对试验.对110份猪血清进行猪伪狂犬病gB抗体化学发光免疫分析法与ELISA法的检测.结果显示,以ELISA法为标准,化学发光免疫分析法检测猪伪狂犬病gB抗体的灵敏度、特异性、符合率分别为98.31%、100%、99.10%,Kappa=0.96,说明化学发光免疫分析法与ELISA法的符合率较高,且其操作步骤更简便,更省时,可以用于临床猪血清样品的猪伪狂犬病gB抗体的检测.     

链霉素快速检测试纸的研制及其性能测定

以分泌抗链霉素(SM)单克隆抗体(mAb)杂交瘤细胞株的建立为基础,应用胶体金免疫层析技术成功研制出SM残留快速检测试纸,并对其敏感性、特异性、重复性、符合性等特性进行了测定。结果表明,检测试纸的检测限为8μg/L;检测上线为100μg/L;与双氢链霉素的交叉反应为100%,与其他抗生素类药无交叉反应;其敏感性与ELISA试剂盒相当,与ELISA试剂盒的检测结果符合率为100%;检测试纸在10 min内显示结果。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

在最佳条件下,通过对重组质粒pGEX-6P-N进行诱导表达,并利用Glutathione Sepharose 4B亲和吸附柱对表达产物（重组N蛋白）进行纯化。用重组N蛋白作为包被抗原,通过对相关条件进行优化（如抗原包被量,血清稀释度,酶标二抗最佳工作浓度,底物作用时间等）,确定判定标准,最终初步建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。用建立的间接ELISA方法检测360份血清样品,并与IDEXX公司研制的ELISA试剂盒检测的结果相比较,批内重复性试验变异系数均值为1.52%,批间变异系数为6.17%,符合率达92.5%,试验表明,建立的间接ELISA检测方法具有良好的重复性和特异性,可用于PRRSV血清抗体的检测。     

重组NP蛋白抗原检测SIV抗体间接ELISA方法的建立

用纯化的H9N2亚型猪流感可溶重组NP蛋白作为包被抗原,建立了检测猪流感抗体的间接ELISA方法.ELISA的最佳工作条件是:抗原包被浓度为12.5 μg/mL,37℃ 1 h,4 ℃过夜;血清稀释度为1∶40;酶标SPA稀释度为1∶10 000,37 ℃温育40 min,底物显色37 ℃ 15 min.经重复性试验、交叉试验、竞争抑制试验等试验,结果表明该方法特异性强、灵敏度高、重复性好.利用TG-ROC软件确定了自制ELISA(NP-ELISA)酶标板的临界值为0.20,特异性和敏感性分别为95.83和91.43.与美国IDEXX试剂盒相比较,符合率为94.00,无显著性差异.用已建立的ELISA方法检测临床血清样本356份,总阳性率为35.40.     

以合成肽为抗原建立口蹄疫病毒非结构蛋白抗体检测ELISA试剂盒

【目的】建立合成多肽抗原检测FMD NSP抗体的ELISA方法。【方法】固相法合成特异性FMDV NSP B细胞表位肽,将其偶联在BSA载体蛋白上,作为抗原包被在ELISA板上,制备检测抗FMDV NSP抗体的ELISA试剂盒,并对该试剂盒进行方法考核。【结果】抗原包被浓度选择2.5μg·mL-1;检测199份血清标本,与美国UBI商品试剂盒符合率达到96.48%,与国产3ABC ELISA比较,符合率为97.48%,显示极好的一致性。【结论】该合成肽ELISA试剂盒可以用以检测NSP抗体,从而鉴别FMD的自然感染与疫苗免疫,试剂盒特异性强,重复性好、稳定性高,操作简便。     

两种口蹄疫O型抗体阻断ELISA检测试剂盒应用比较

为评估两种常用口蹄疫O型抗体检测试剂盒的性能差异,本实验室对2020年春季随机抽检的三家规模养殖场提供的60份猪血清分别用液相阻断ELISA和固相阻断ELISA两种试剂盒进行了检测,并比较了两种试剂盒检测结果的阳性检出率和符合率。结果表明,两种方法检测结果总符合率为91.67%,符合率高。在基层畜牧兽医部门日常定性检测中,推荐使用固相阻断ELISA检测试剂盒。     

ELISA方法检测动物源性食品中卡那霉素研究

为评价卡那霉素检测试剂盒的现场应用效果,结合仪器检测方法,对现场采集的样品同时进行HPLC-MS检测和ELISA检测,然后进行统计分析。结果表明,卡那霉素HPLC-MS检测和ELISA检测动物组织和肝脏样品816份,ELISA检测试剂盒检出率较高,与仪器的符合率达98.99%,卡那霉素ELISA检测试剂盒敏感性好、时间短,不存在假阴性。卡那霉素ELISA检测试剂盒可以用于动物源性食品的检测工作,适用于现场、大范围的快速筛选。     

基于gB蛋白的牛传染性鼻气管炎间接ELISA检测方法的建立

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachetitis virus,IBRV）的早期快速检测方法,并能判定免疫后是否再次发生感染,本研究利用原核表达IBRV gB蛋白,并通过SDS-PAGE和Western blot检测gB蛋白的表达,并初步建立基于gB蛋白检测IBRV的间接ELISA方法。结果表明：1）对IBRV标准阳性血清,本试验方法的最低检测限度为1∶4 096,说明建立的gB-ELISA检测方法具有较高的敏感性。2）该方法对其他4种常见的牛疫病阳性血清检测均为阴性,不存在交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。3）在对200头牛的临床样品的检测中,该方法与IDEXX(IBRV gB X3)抗体检测试剂盒符合率高达97.5%。综上,本研究建立的gB-ELISA检测方法敏感性高,特异性好,该方法为开发一种在感染早期快速对疾病进行诊断,并可以判定疫苗免疫后是否再次发生IBRV感染的试剂盒奠定基础。     

Development of a sandwich Dot-ELISA for detecting bovine viral diarrhea virus antigen with E2 recombinant protein

The IgG antibodies of rabbit anti-E2 protein of the bovine viral diarrhea virus were prepared by a general method from high efficiency serum immunized by E2 recombinant protein antigen expressed in E. coli prokaryotic expression system and were labeled to make enzyme-labeled antibody with the method of NaIO₄. A sandwich Dot enzyme-linked immunosorbent assay (Dot-ELISA) for the detection of BVDV was developed. The optimal reaction conditions of Dot-ELISA were determined. The results show that optimal coating antibody was 300 μg·mL⁻¹, the working concentration of HRP-labeled antibody was 1:50. The optimal blocking reagent and time were 5% bovine serum and 45 min. The minimum detection of the content of antigen reached 1.35 μg·mL⁻¹. Compared with the routine IDEXX ELISA test kit with the whole virus, its specificity, sensitivity and coincidence rate were 90.48%, 96.55% and 95.24%, respectively. Compared with the sandwich Dot-ELISA with the negative staining electron microscope and RT-PCR, the coincidence rates were 90.9% and 93.1%, respectively. In addition, Bovine viral diarrhea virus (BVDV) antigen of 178 samples collected from cow farms in the Hebei Province, China, were detected by the developed Dot-ELISA and the IDEXX BVDV antigen Test Kit simultaneously, BVDV antigen positive rate was 39.89%–41.01%. The result of detecting clinical samples demonstrated that the established method showed its specificity, sensitivity and repeatability, whereas the results were easily interpreted without an ELISA reader.     

副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒的研制与应用

【背景】副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS）是猪的上呼吸道病原菌,引起格拉瑟氏病,主要引起断奶前后和保育阶段的猪发病,通常见于5—8周龄的青年猪,发病率一般为10%—15%。该菌有15种血清型,目前主要养猪国家流行的血清型为4型、5型、12型和13型,是严重危害养猪业发展的主要细菌性病原之一。目前国内还没有检测该菌抗体的商品化试剂盒。【目的】研制一种针对副猪嗜血杆菌的快速、敏感和特异性强的抗体检测试剂盒,为格拉瑟氏病的有效防控提供技术支持。【方法】表达并纯化OppA、DppA、HbpA 3种不同的副猪嗜血杆菌ABC转运体周质底物结合蛋白,使用副猪嗜血杆菌阴、阳性参考血清筛选以上3种蛋白中免疫反应性和反应特异性好的蛋白。以筛选的蛋白为包被抗原,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,优化间接ELISA反应条件,并组装试剂盒。在此基础上,确定该试剂盒的敏感性、特异性;通过对不同时间、不同猪场采集的2 000份临床猪血清样本进行检测,评价该试剂盒的实用性;在以上临床血清样本中随机选取200份,分别以研制的试剂盒、间接血凝试验以及进口商品化试剂盒进行检测,比较检测结...     

新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒的应用

[目的]研发一种成熟稳定的新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒.[方法]在新孢子虫病rELISA检测方法建立的基础上,组装检测新孢子虫病的rELISA抗体检测试剂盒,对试剂盒的敏感性、保存期、特异性和重复性进行评价,并与两种商品化试剂盒进行对比试验,应用自制的试剂盒检测来自新疆各地州新孢子虫疑似病例区血清,共1329份.[结果]成功组装了新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒,且该试剂盒敏感性高、保存期长、特异性强、重复性较好.与两种进口商品化诊断试剂盒比较,其符合率均在90;以上.在1 329样品血清中157份是阳性,其平均阳性率为11.8;.[结论]该试剂盒可以取代商品化试剂盒进行新孢子虫病诊断,为新孢子虫病的防治工作提供技术和产品支撑.     

呋喃西林代谢物酶联免疫检测方法的建立

[目的]建立动物性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测方法。[方法]通过制备特异性强的单克隆抗体,采用间接竞争ELISA法建立动物性食品中呋喃西林代谢物ELISA检测方法,并研制出对动物性食品中呋喃西林代谢物残留检测的试剂盒。[结果]该试剂盒标准曲线的IC50值为0.267 7μg/L,最低检测限为0.1μg/kg,样本加标回收率范围为79.5%～95.6%,变异系数为7.6%～9.7%。在交叉反应试验中,对呋喃西林的交叉反应率为25%,与其他药物的交叉反应率均小于1%,表明该方法具有很强的特异性。[结论]该方法灵敏度、准确度、精密度均较高,能满足兽药残留的检测要求,且检测时间短(45 min),样本前处理简单、检测成本低,适合于大量样本中呋喃西林代谢物残留检测的快速筛选。     

牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立高通量牛布鲁氏菌间接ELISA诊断方法,为科学高效诊断牛布鲁氏菌病提供技术手段。【方法】以提纯的猪布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为包被抗原,采用棋盘滴定法确定了抗原包被浓度、包被液、抗原包被时间、封闭液、样品稀释液、血清稀释倍数、兔抗牛酶标抗体稀释液、兔抗牛酶标抗体稀释浓度、最佳TMB底物反应时间等参数,初步建立了牛布鲁氏菌间接ELSIA方法。并用上述条件初步建立的方法对176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌病阴性血清进行检测。检测结果经SPSS17.0软件分析,构建受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积,确定敏感性和特异性;通过Youden指数确定阴阳性判定的临界点。使用质控阴、阳性血清评价试剂盒的批内和批间重复性。用本研究建立的ELISA试剂盒及商品化试剂盒同时对临床上1 200份牛血清样本进行比对检测,比较其符合率。【结果】通过棋盘法确定的试剂盒中各组分的最佳条件为:抗原包被浓度为10μg·m L-1,最适包被液为碳酸盐缓冲液,最佳包被时间为2—8℃、16 h,最适血清稀释度为1﹕50,最佳封闭液为含有3%明胶的PBST,最佳样品稀释液为含有0.5%蔗糖的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体稀释液为含有5%马血清的PBST,最佳兔抗牛酶标抗体工作浓度为1﹕20 000,最佳TMB底物反应时间为15 min。按上述条件建立的间接ELISA方法检测176份牛布鲁氏菌病阳性血清和132份牛布鲁氏菌阴性血清,并统计结果后使用SPSS17.0软件分析该方法受试者工作特征曲线(ROC)线下面积为0.98。最佳判定临界点为样本OD值/阳性OD值(S/P)×100%=20%。在此临界值上时,敏感性为97.7%,特异性为95.5%。对1 200份临床样本的比对检测显示,本研究建立的间接ELISA方法与进口商品化试剂盒的总符合率为96.25%。【结论】建立了特异性和敏感性良好的牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒夹心ELISA快速检测方法的建立与初步应用

用增殖与浓缩后的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)分别免疫健康牛犊和家兔,制备牛抗BVDV和兔抗BVDV超免疫血清,并用层析法纯化牛抗BVDV IgG和兔抗BVDV IgG,建立了检测BVDV的双抗体夹心ELISA快速检测方法.结果表明:该检测方法的最佳反应条件为:牛抗BVDV IgG包被浓度为100μg/mL,兔抗BVDV IgG最佳工作浓度为50μg/mL,样品反应时间为90min,酶标抗体工作浓度为1∶8 000,以D490nm≥0.177作为阳性判定标准.该ELISA检测方法的重复性CV小于10%,最低检测限为1.87μg/mL,与牛轮状病毒、牛冠状病毒、猪瘟病毒、犊牛大肠杆菌和沙门菌等病原无交叉反应,该ELISA试剂在室温下至少可保存6个月.用该ELISA方法和IDEXX公司抗原检测试剂盒对甘肃省不同地区牛场156份临床粪便样品进行了检测,阳性检出率分别为17.3%和16.7%.表明本试验建立的ELISA方法特异性强、敏感性高且重复性好,可用于BVDV的快速检测.     

布鲁氏菌病不同初筛方法及诊断试剂检测差异性分析

[目的]应用布鲁氏菌病4种初筛方法及11种商品化诊断试剂检测新疆地区采集的207份牛、羊血清学样品,分析结果差异,对方法及产品进行评价.[方法]以英国参考实验室APHA竞争性ELISA试剂盒检测结果为标准,确定布鲁氏菌病牛阳性血清78份、阴性57份,羊阳性血清52份、阴性20份.应用RBT抗原(Ⅰ)、(Ⅱ),FPA抗原...     

应用重组杆状病毒表达的IBDV VP2抗原建立其抗体监测方法

应用B ac-to-B ac杆状病毒表达系统表达的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)JS株VP 2基因的重组杆状病毒reB acm id-VP 2蛋白,建立抗IBDV血清抗体的间接EL ISA检测方法,研究IBDV VP 2蛋白的结构与功能。结果表明:该方法与进口试剂盒平行检测对比试验显示,其敏感性为93.4%,特异性为90.9%;对VP 2亚单位疫苗免疫的血清样本的8次重复检测,变异系数小于4%,表明该检测方法对VP 2亚单位疫苗免疫效果的监测、评价具有更高的可靠性。     

PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法的建立

用亲和层析纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400 ng,待检血清最佳稀释度为1∶100,待检血清样品的D_(490 nm)≥0．43D_(po■) 0．57D_(neg)判为阳性,反之判为阴性。对采自14个猪场的364份猪血清样品进行检测,PRRS阳性率为51．4%,略高于HerdChek ELISA的阳性检出率49．7%。与HerdChek ELISA相比,间接ELISA的敏感性为94．5%,特异性为91．3%,总符合率为92．9%,Youden指数为0．86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性,并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。该方法的成功建立将为我国PRRS的防制工作作出贡献。