小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg（Viral protein genome\|linked）作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号（NLS）序列,C端具有核输出信号（NES）序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP\|VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP（n）标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

小麦黄花叶病毒P3蛋白致病功能域的鉴定和分析

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus),其基因组由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。先前的研究表明,马铃薯Y病毒组多种病毒编码的保守蛋白P3具有多种功能,在病毒复制、致病性、克服宿主抗性、细胞间移动等方面均具有重要作用,而P3在大麦黄花叶病毒属中是否有类似功能目前还未见报道。本研究利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的本氏烟基因沉默系统,明确了WYMV的P3碳端在本氏烟上具有致病功能域P3-C,但完整的P3则不具有致病能力。进一步移码突变研究表明,P3-C的致病性是由其编码的多肽引起的,而非病毒来源的小干扰RNA介导的宿主基因沉默。同时P3-C的两个跨膜结构域对致病性具有重要作用,单独表达任何一个跨膜结构域P3-C均不能在本氏烟上引起明显症状。     

CP基因3''''端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

马铃薯X病毒3′末端分子克隆及序列分析(简报)

马铃薯 X 病毒(PVX)是马铃薯 X 病毒组的典型成员。它危害马铃薯、辣椒、烟草等作物,造成马铃薯减产20%左右,还通常与马铃薯 Y 病毒复合侵染,危害严重,产量损失高达80%以上。近年来,利用病毒基因组编码的外壳蛋白基因(Coat Protein,CP)、复制酶基因及卫星 RNA 等的交叉保护作用,先后获得了抗病毒马铃薯、烟草、番茄等工程植株。本文报道马铃薯 X 病毒(辣椒分离株)3′末端的分子克隆及序列分析。     

南京小麦梭条花叶病毒RT—PCR的分子鉴定

采自江苏省南京市郊区的小麦病毒病样品提纯后 ,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,结果表明 ,病毒外壳蛋白 (CP)为单一组分 ,相对分子质量为 36 5× 10 3 。经 1 2g·dL-1琼脂糖凝胶电泳检测 ,病毒核酸有两个组分 ,即RNA1和RNA2。根据AnbeSohn发表的小麦梭条花叶病毒RNA 13′端部分核苷梭序列 ,设计一对引物 ,以提纯样品的RNA1为模板 ,经RT PCR扩增出包含CP基因在内的 1 7kb的特异性目的片段 ,据此鉴定所采集的毒原为小麦梭条花叶病毒 (WSSMV)。     

转病毒移动蛋白及复制酶基因烟草的协生和重组风险分析

 对转化番茄花叶病毒 (ToMV)、烟草花叶病毒 (TMV)移动蛋白 (MP)基因和黄瓜花叶病毒P1株系(CMV P1)部分复制酶基因的 3种转基因烟草 ,分别接种马铃薯X病毒 (PVX)、马铃薯Y病毒 (PVY)、CMVRB株系 (CMV RB)和TMV。症状观察和ELISA测定发现 ,各病毒在转基因烟草和非转基因烟草上的症状及病毒浓度没有显著差异 ,表明这些病毒在转基因烟草上没有协生作用发生。对转化ToMVMP基因和转化CMV P1部分复制酶基因的转基因烟草 ,分别接种TMV和CMV RB ,定期进行生物学、ELISA和免疫捕获反转录PCR(IC RT PCR)检测 ,在 16个月的连续测定中未发现病毒重组现象。     

玉米叶片中甘蔗花叶病毒检测及其基因组31端序列分析

在云南元谋采集的玉米叶片样品上获得一病毒分离物,经生物学(摩擦接种)、血清学(DAS-ELISA)和分子生物学(RT-PCR)鉴定,确定为甘蔗花叶病毒(Sugarcane Mosaic Virus,SCMV).为分析其基因组3’端特性,以叶片中提取的总RNA为模板,对基因组3’端进行RT-PCR扩增,产物克隆到pMD1...     

杭州地区辣椒病毒病病原分子鉴定

通过双链RNA提取分析和病毒提纯与外壳蛋白，研究分析了杭州地区辣椒病毒病发生的情况，接合寄主生物学鉴定，发现侵染杭州辣椒的主要病毒为烟草花叶病毒属（Tobamovimses）和黄瓜花叶病毒（CMV）；且CMV的发病率明显低于Tobamovirses；同时，杭州地区辣椒上还可能存在前人未发现的新病毒或病毒因子，其dsRNA基因组大小约为1700hp。     

马铃薯抗逆基因Fe-SOD的克隆与序列分析

文章以马铃薯克新19号为材料,提取植株叶片总DNA,利用同源序列法,根据GenBank中已登陆番茄的Fe-SODmRNA序列,设计1对引物,经PCR扩增获得了大小为1413bp的片段。序列分析表明,预测其含有4个外显子和3个内含子,编码了145个氨基酸序列,分子质量为16.255ku,等电点为5.88。其编码的氨基酸序列包含了两个Fe-SOD蛋白的保守结构域,与NCBI数据库中其他植物的Fe-SOD蛋白同源性很高,与番茄中58～203相关片段同源性高达93.79%。该基因已在GenBank上注册,登录号为EU545469。     

人巨细胞病毒pp150抗原区基因片段的克隆与表达

为了研制人巨细胞病毒(HCMV)核酸疫苗,根据HCMV基质磷蛋白pp150基因序列设计引物,利用高保真PCR从HCMV AD169株基因组DNA中扩增出编码pp150抗原决定簇区域的基因片段.序列分析结果显示其与发表的该段序列同源性为100%.将此基因片段克隆进原核表达质粒pET30a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后经SDS-PAGE及Western blotting检测到约35 h的外源蛋白.表达产物免疫小鼠,所得抗体具有低滴度中和作用.     

日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白基因的克隆及原核表达

为了得到重组的日本血吸虫22.6 ku膜相关蛋白,研究设计了1对引物,以日本血吸虫mRNA为模板,用RT-PCR方法克隆了576 bp的22.6 ku膜相关蛋白基因片段,测序结果表明,该片段与已公布的Sj22.6基因序列(U75510)同源性达到99%。将该基因片段插入原核表达载体pGEX-KG构建了原核表达质粒pGEX-Sj22.6,在大肠杆菌BL21 codn plus中表达获得了约48 ku的融合蛋白,经Western-blot检测,该重组蛋白具有良好的免疫原性。     

辣椒素生物合成途径基因pal克隆及原核表达分析

以辣椒品种"益都红"胎座RNA反转录的cDNA为模板,根据pal基因保守序列设计引物,PCR扩增得到1条全长2157bp的目的片段。该基因包含有完整的开放阅读框架,编码718个氨基酸,预测的分子质量为73ku。与多种植物PAL的氨基酸序列有一定的同源性,其中与同科同属植物朝天椒的同源性最高。应用分子克隆的方法成功地构建了pET-32a-pal重组表达质粒,优化得到诱导表达的最佳条件为:IPTG0.3mmol·L-1,温度28℃,时间6h,经SDS-PAGE检测6×His-PAL在E.coli中得到了高效表达,重组蛋白分子质量约为93ku。因此,该基因的克隆与原核表达为深入研究辣椒PAL的基因结构、生物活性、表达调控机制以及辣椒素的生物合成机制奠定了重要基础。     

刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达

根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别.     

猪Hepcidin基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术从猪肝脏总RNA中扩增出Hepcidin基因的编码序列,将该序列及其推导的氨基酸序列与其它17个已知物种的相应序列进行同源性分析,并构建系统进化树。结果表明,克隆得到的Hepcidin基因cDNA序列长278 bp,编码82个氨基酸,预测的蛋白分子质量和等电点分别为8.76 ku和9.06;与已知牛的Hepcidin序列同源性最高,达81.71%,不同物种Hepcidin蛋白具有高度的保守性,Hepcidin蛋白物种进化树符合物种进化规律。本研究为今后阐明Hepeidin基因表达特性、表达产物理化性质、抗菌活性及其相关功能等奠定基础。     

胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆与序列分析

以胡萝卜幼苗为材料,提取基因组DNA,根据GenBank中的已知序列设计引物,利用聚合酶链式反应技术(PCR)体外扩增获得胡萝卜抗冻蛋白基因(AFP),将其连接到pGEM-Teasy vector载体上,并对其进行生物学信息分析.结果表明:克隆的AFP基因片段全长1 206bp,其中编码区长1 026bp,共编码341个氨基酸,蛋白质分子量为38.048ku,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主.与GenBank中(A91926.1)的基因序列和氨基酸序列比较,同源性分别为99.4%和97.6%,表明AFP基因克隆成功.与不同地方品种胡萝卜AFP基因做同源性比较,结果发现不同品种间的AFP基因保持着很高的内同源性.     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia17基因克隆、表达的研究

根据cry1I类基因的全长序列设计引物,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)菌株BtMX2的总DNA为模板扩增出片段长为2.1 kb的cry1I的全长基因,插入大肠杆菌(Escherichia coli)表达栽体pEB,转化大肠杆菌Rosetta茵株,诱导表达出81 ku的蛋白,编码的...     

牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆与原核表达

根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753 bp的片段.将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定.测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Roset...