野百合AFLP反应体系的建立及优化

以重庆市巫山和巫溪两地的野百合为实验材料,对实验中涉及的各个重要试剂,如接头浓度、预扩和选扩模板稀释倍数及dNTP等的用量进行梯度比较,确定最佳用量.结果表明：①改良的CTAB法提取的野百合基因组DNA经过纯化后符合AFLP实验要求;②接头浓度为50pmol/μL较好;③酶切连接产物稀释20倍,dNTP用量为1.0μL（50μL体系）,72℃开始扩增较好;④预扩增产物稀释30倍最佳.⑤从64个引物组合中筛选出符合野百合AFLP反应的20对引物组合.因此,优化后的体系适合野百合遗传多样性研究.     

银杏AFLP反应体系的建立及优化

以6个银杏种质为试材,通过对影响AFLP技术的多种因素进行研究,建立了一套适合银杏的AFLP技术优化体系。优化的关键因素为:①模板DNA的质量:经多次抽提纯化,将DNA沉淀挑出,而不采用离心方法,获得高纯度的DNA;②酶切时DNA模板为300 ng,反应时间为6 h;③连接最适反应时间为10 h;④预扩模板即连接产物最佳用量为1μl;⑤预扩增产物最适稀释倍数为70倍。     

杜仲AFLP反应体系的建立及优化

【目的】建立并优化适合杜仲的AFLP技术体系,为进一步构建其遗传图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对杜仲基因组DNA提取方法、酶切与连接体系、预扩增和选择性扩增程序的影响因素进行分析,并对适合杜仲AFLP分析的引物组合进行筛选。【结果】模板DNA的提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量500 ng,酶切时间6 h,连接反应时间6 h,预扩增产物最适稀释倍数30倍。同时筛选出E-AAG+M-CAA,E-AAG+M-CAT,E-AAG+M-CTA,E-AAG+M-CTG,E-ACA+M-CAA,E-ACA+M-CTA,E-ACC+M-CTG共7对适合杜仲AFLP分析的引物组合。【结论】经重复验证,建立的AFLP反应体系适用于杜仲的AFLP分析。     

南瓜AFLP反应体系的建立与优化

以印度南瓜矮生等基因系yd为材料,从叶片中提取基因组DNA,对酶切、连接、预扩、选扩反应体系及银染方法进行优化研究,建立高效稳定的南瓜AFLP反应体系,即反应体系为DNA模板量500 ng、37C酶节5 h、连接3 h、预扩产物稀释50倍及Mg2+1.5 mmoL/L、dNTP 0.19 mmoL/L的效果最好.     

白桦AFLP体系的建立及优化

以不同白桦个体为材料,通过琼脂糖凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析了DNA提取、双酶切、连接、预扩增和选择性扩增过程中的各影响因素,建立了扩增酶切片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism)分析体系,并用E2 M4引物对不同白桦个体进行了扩增,得出优化的关键因素分别为:模板DNA的质量浓度为0.094g/L和0.086g/L,符合AFLP分析中的双酶切要求;酶切反应时间为2h15min;连接最适反应时间为2h;预扩增PCR的退火温度设为60℃。银染结果表明:扩增信号强,无背景干扰,条带清晰。     

华北落叶松AFLP反应体系的建立和优化

[目的]建立和优化华北落叶松（Larixprincipis-rupprechtii Mayr.）的AFLP反应体系。[方法]以华北落叶松为材料,对其AFLP分析过程中的5个主要影响因素（酶切时间、内切酶用量、DNA模板用量、连接产物和预扩增产物稀释倍数）进行了研究。[结果]确立了适于华北落叶松AFLP分析的最佳反应体系,即在反应体积均为20.0μl的前提下,酶切时间为7 h（37℃3.5 h;65℃3.5 h）,EcoRⅠ和MseⅠ内切酶用量均为1 U,DNA模板用量为3.0μl（50 ng/μl）,连接产物稀释10倍取5.0μl用于预扩增,预扩增产物稀释70倍取4.0μl用于选择性扩增。[结论]采用该体系得到的电泳条带清晰可辨、多态性好、重复性强,可用于对华北落叶松遗传多样性和分子进化特征的深入研究。     

青稞AFLP体系的建立及优化

本文以青稞为材料,对AFLP酶切连接、预扩增、选择性扩增过程进行优化。结果表明,酶切反应条件为DNA模板200 ng、限制性内切酶Eco RI/Mse I 4U、酶切时间4h;连接反应条件为连接温度16℃,T4连接酶3 U,连接时间12 h以上;预扩增反应条件为r Taq聚合酶3 U、dNTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.00 mmol/L;选择性扩增反应条件为r Taq聚合酶4 U、d NTP 4 mmol/L、镁离子浓度1.25 mmol/L及预扩产物稀释10倍。利用优化后的AFLP体系,以藏青2000、冬青18这2个供试材料的基因组为模板,从100对引物组合中筛选出10对重复性好、稳定性强、扩增条带清晰、分布均匀、多态性高的引物组合,为青稞种质资源鉴定及遗传多样性分析提供了基础。     

黄瓜AFLP反应体系的优化

对影响AFLP(Amplified fragment length polymorphism)扩增的关键因素进行了摸索,以期获得清晰稳定的黄瓜AFLP反应体系。结果发现,最佳的预扩增体系为:20反应体系中包含0.5 UTaqDNA poly-merase、2.0μL dNTP(2 mmol/L)、1.2μL 25 mmol/L Mg2 、0.6μL 50 ng/μL每种引物、1×PCR Buffer和4μL模板DNA;最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0 UTaqDNA polymerase、2.0μL dNTP(2 mmol/L)、1.0μL 25 mmol/L Mg2 、1.0μL 50 ng/μL每种引物、3.0μL稀释40倍的预扩增产物和1×PCR Buffer。体系优化后,扩增产物稳定,条带十分清晰,无背景干扰。     

松毛虫AFLP反应体系的建立及引物筛选

为研究不同环境条件下松毛虫的遗传多样性,以油松毛虫为材料研究松毛虫的AFLP反应体系。对选择性扩增中的预扩增产物稀释倍数、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了比较分析。结果显示,在选择性扩增体系中,预扩增产物稀释40倍,Mg2+浓度1.5 mmol/L、dNTP浓度0.2 mmol/L,引物浓度0.500pmol/L,Taq酶用量为1U,扩增产物经5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可以得到稳定的结果。用优化的AFLP反应体系,以油松毛虫、赤松毛虫和马尾松毛虫为材料筛选引物,从81对引物组合中筛选出10对多态性高的引物组合。     

蜡梅AFLP反应体系优化及引物筛选

通过对影响AFLP反应体系主要因素的优化,建立了蜡梅的AFLP反应体系,并筛选出了适宜该体系分析的引物.结果表明,20μL蜡梅AFLP最佳酶切体系为模板600 ng DNA,3 U Pst I和3 U Mse I,在37℃下双酶切2 h;在20μL最佳连接体系中酶切产物为15μL,3 U T4连接酶,0.25μmol.L-1 Pst I接头,2.5μmol.L-1 Mse I接头,1μL 10×T4 Buffer,在22℃下连接10 h;在20μL最佳预扩反应体系中稀释10倍的连接产5μL,2.0mmol.L-1 Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC);在20μL最佳选择性扩增反应体系中5μL稀释20倍的预扩增产物,2.0 mmol.L-1的Mg2+,2 U Taq酶,300μmol.L-1 dNTP,0.5μmol.L-1 Pst I和Mse I引物(P+AGA/M+ATC).最后,利用上面的体系筛选出了96对适宜于蜡梅AFLP分析的引物.     

企鹅珍珠贝AFLP反应体系建立的研究

为了将AFLP技术应用到企鹅珍珠贝相关研究中,以企鹅珍珠贝为材料,采用SDS-CTAB改进法DNA提取高质量的基因组DNA,通过对AFLP双酶切体系、连接体系、预扩增体系及选择性扩增体系中关键因素进行优化,建立了适用于企鹅珍珠贝的AFLP反应体系.同时以3个企鹅珍珠贝地理群体为材料,采用新建立AFLP反应体系从256对引物组合中筛选出10对多态性高的AFLP引物组合,说明建立的优化体系可用于企鹅珍珠贝的AFLP分析.     

龙眼AFLP银染体系的建立与优化

[目的]优化龙眼AFLP银染体系中的影响因素。[方法]以23份龙眼品种和2份龙眼近缘植物龙荔为试材,通过对扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系中的几个影响因素(DNA提取、酶切与连接、电泳与银染)进行研究,建立起龙眼AFLP银染分析体系。[结果]用紫外分光光度计检测样品DNA质量和浓度,发现提取的DNA吸光度A260/A280比值在1.8左右,A260/A230的比值大于2.0,说明所提取的DNA样品纯度较高,无蛋白质或盐类的污染。酶切与连接中采用37℃水浴5 h,然后转入65℃水浴2 h的方法能保证酶切充分,又能防止酶切过度。电泳和银染时用4℃预冷的显影液进行显影,可以降低显影速度。[结论]采用该技术体系得到的AFLP指纹式样清晰,重复性强,适宜用作龙眼品种鉴别和遗传多样性分析。     

克氏原螯虾AFLP反应体系的建立

以克氏原螯虾DNA为材料,对AFLP分析中的基因组酶切时间、选择性扩增中预扩增产物稀释倍数、Mg~(2+)浓度等3个因素进行了比较.结果表明,基因组用EcoR I和MseI双酶切5h,选择性扩增的PCR反应体系中Mg~(2+)1.5 mmol/L是进行克氏原螯虾AFLP分析的最佳反应条件,能够得到丰富稳定的带纹.而预扩增产物稀释倍数对选择性扩增没有明显影响.该体系的构建为AFLP技术在克氏原螯虾相关研究中的应用奠定了基础.     

辣椒AFLP技术体系的建立与优化

以辣椒细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B为材料,通过对影响辣椒AFLP技术体系的若干关键因素,如提取DNA的方法、酶切与连接、预扩增和选择性扩增以及电泳和染色条件等的研究,建立了经优化的适合于辣椒的AFLP分子标记技术体系。采用该体系,对辣椒进行AFLP分析,能够得到清晰稳定的分子标记图谱,为今后利用AFLP技术进行辣椒细胞质雄性不育基因的定位奠定了技术基础。     

大竹蛏AFLP分子标记反应体系的建立与优化

[目的]建立一套适合大竹蛏的AFLP分子标记反应体系,为大竹蛏的遗传多样性研究提供技术支持。[方法]采用比较实验法,以大竹蛏基因组DNA为模板,对其AFLP体系中的酶切时间、预扩产物稀释倍数及选扩引物E＋3/M＋3的配比等进行优化。[结果]优化的AFLP体系为：酶切时的DNA模板浓度为100 ng/μl,双酶切2 h;预扩模板最佳用量1.0μl;预扩产物的最适稀释倍数为40倍;选扩引物浓度配比为1∶4。同时,筛选出12对引物组合,可用于大竹蛏的AFLP分析。[结论]采用优化的AFLP反应体系及筛选后的引物,对大竹蛏群体进行了初步扩增,得到了清晰的电泳图谱。     

唇(鱼骨)基因组AFLP反应体系的建立及优化

以唇(鱼骨)为实验材料,通过对扩增片段长度多态性(AFLP)的几个关键技术参数进行研究,建立适合于唇(鱼骨)的AFLP反应体系.结果显示-通过DNA的质量、酶的浓度、酶切时间及扩增时稀释倍数等条件的调整,EcoRI、Tru9I酶切组合和PstI、TaqI酶切组合均能够获得清晰可靠的图谱,二者的结果比较显示,EcoRI、Tru9I酶切组合扩增结果的多态性要稍差于PstI、TaqI酶切组合的扩增结果,为利用AFLP标记对唇(鱼骨)基因组进行深入研究打下基础.     

核桃AFLP银染技术体系的建立

为了建立准确、高效、实用的核桃AFLP体系,应用于核桃品种鉴别、优异基因的分子标记,本试验针对核桃叶片中多糖、酚类等次生代谢物比较多的特点,采用改良CTAB法,通过添加抗氧化物质,得到了适合核桃AFLP分析的基因组DNA提取方法;在此基础上进行了AFLP体系中主要参数的优化研究,比较了两种银染方法的效果,并从64对选择性扩增引物中筛选出了18对适合核桃AFLP分析的引物,建立了能得到清晰指纹分析图像的核桃AFLP技术体系。     

杞柳AFLP反应体系的建立与引物筛选

以杞柳F1群体为试验材料,采用改良的CTAB法提取基因组DNA,经过酶切、连接、预扩增和选择性扩增,建立杞柳AFLP的反应体系,筛选EcoRI和MseI各16条选择性扩增引物组成256对引物组合。结果表明:320 ng基因组DNA采用5U EcoRI和MseI双酶切6 h,20℃连接12 h,连接产物稀释10倍进行预扩增,预扩增产物稀释15倍进行选择性扩增,选择性扩增产物采用ABI-3130检测,可获得条带清晰的指纹图;从256对引物组合中共筛选出98对多态性较高的引物组合。