双向电泳检测奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质方法的建立

为研究不同激素或营养素对乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响,本实验建立细胞核磷酸化蛋白质提取方法及双向电泳实验技术。结果表明,细胞核磷酸化蛋白纯化结合双向电泳技术是乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学研究的有效方法,可为进一步研究乳腺上皮细胞机理提供技术基础。     

双向电泳分析蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的影响

为了寻找奶牛乳腺上皮细胞核中与乳蛋白合成相关的重要蛋白质,从翻译水平揭示乳蛋白合成的机理,本试验应用双向凝胶电泳技术和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的方法,分析添加蛋氨酸后奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质的变化,并采用Western blotting验证。质谱分析鉴定出5个表达上调的细胞核磷酸化蛋白质,分别是葡萄球菌核酸域包含蛋白质1、甘氨酰-tRNA合成酶、Septin-6、Twinfilin-1和延长因子1-beta,这些蛋白质的功能涉及DNA转录、mRNA翻译、蛋白质合成、细胞分裂、细胞形态发生及细胞周期的调控。     

蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞蛋白质组的影响研究

为寻找奶牛乳腺上皮细胞亚细胞结构中与泌乳相关的重要蛋白质、从蛋白质水平揭示乳蛋白合成的调控机制,应用双向凝胶电泳技术分离体外培养的蛋氨酸处理组与正常组奶牛乳腺上皮细胞蛋白质,利用Image Maser 2D软件对图谱进行对比分析,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和数据库检索鉴定,并采用实时荧光定量PCR技术在mRNA水平上验证2-DE结果。质谱鉴定出8个表达上调的差异蛋白质,大多数差异蛋白质的功能涉及细胞骨架构成、能量代谢等过程。这些差异点的发现为研究奶牛泌乳机理提供了有益的线索。     

奶牛乳腺上皮细胞系的建立

采用组织块种植法,成功地培养了奶牛乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过对细胞接种存活率、群体倍增时间、生长曲线、形态学等生物学性状的检测,建立并鉴定了正常培养的奶牛乳腺上皮细胞系,细胞传至20代以上时仍保持旺盛的增殖活力。通过对细胞传代及反复冻存,建立了奶牛乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。     

健康奶牛与临床型乳腺炎奶牛乳腺核蛋白组差异表达分析

亚细胞蛋白质组的优点在于对低丰度蛋白的研究,运用亚细胞蛋白质组学的研究策略,可以提高低丰度蛋白质在双向电泳中的检出数量.通过分析奶牛乳腺炎乳腺与正常乳腺核蛋白组差异表达情况,为奶牛乳腺炎发病机理研究寻找尽可能多的生物标记分子.经超速离心法分离细胞核,双向凝胶电泳分离蛋白,用PDQuest7.4软件分析寻找差异蛋白质斑点,高效液相色谱串联离子阱质谱鉴定蛋白质.从核蛋白组2-DE图谱中筛选出22个差异表达的蛋白质斑点,质谱鉴定出17个差异表达的蛋白质,2个蛋白质在乳腺炎发病过程中下调,7个上调,5个只在正常情况下表达,3个只表达在乳腺炎组织中,筛选出的差异表达蛋白质涉及细胞骨架构成、代谢调节及凋亡调控等许多方面.表明奶牛乳腺炎发生时乳腺组织核结构和代谢状态都发生了的变化.     

雌激素处理的奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质组学分析

雌激素调节多种生理过程,包括乳腺生长发育、形态发生、增殖和分化及乳蛋白的表达。许多磷酸化蛋白调节乳蛋白合成,如磷酸化Stat5和mTOR,但在乳蛋白合成的转录和翻译后水平的调节鲜有报道。为了阐述雌激素在奶牛乳腺上皮细胞中的作用机制,本试验利用双向电泳和质谱分析,鉴定了雌激素调节的细胞核磷酸化蛋白质。在雌激素处理24h后,鉴定出7个表达上调的蛋白质,包括以前报道过的甘氨酰-tRNA合成酶,属于氨基酰-tRNA合成酶家族Ⅱ;这些蛋白质涉及翻译起始因子、GTP结合的核蛋白、热休克蛋白、泛素-蛋白酶体系统。这些筛选出来的蛋白质,揭露了雌激素影响奶牛乳腺上皮细胞核磷酸化蛋白质,为进一步研究乳合成的分子机制提供一个新的途径。     

不同方法分离奶牛乳腺上皮细胞体外培养的研究

从荷斯坦奶牛乳房无菌采取乳腺组织,通过不同的方法分离、培养、纯化牛乳腺上皮细胞,研究乳腺上皮细胞的体外培养效果.结果表明:组织块接种、0.25%的胰酶和100 u/mL透明质酸酶的混合液37℃消化组织块3 h.可以得到大量细胞用于原代培养.在以DMEM/F12为基础培养液,在培养液中添加10%的胎牛血清、100μg/mL的双抗、表皮生长因子、胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠等,组成的完全培养液中奶牛乳腺上皮细胞生长良好.上皮细胞显微结构显示:奶牛乳腺上皮细胞在体外培养过程中舍有不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈多角形,细胞之间连接成片,细胞界限明显,部分细胞界限不明显.     

奶牛乳腺上皮细胞的培养与鉴定

本试验通过组织块培养法获得了奶牛乳腺上皮细胞,联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法对细胞进行纯化,应用倒置显微镜和β-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达,鉴定该细胞为上皮型细胞。     

过氧化氢诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤模型的建立

本试验旨在利用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)作为刺激源,以细胞存活率及抗氧化指标为判断指标,建立奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)的氧化损伤模型。试验一采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为42组,每组10个重复。细胞培养液中分别添加0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L H2O2,使之分别作用2、4、6、8、12、24 h,测定细胞数量,计算存活率。试验二是在试验一得出的适宜H2O2作用时间(本试验的结果为6 h)的基础上,采用单因子完全随机试验设计,将第3代贴壁生长的BMEC随机分为7组,每组6个重复,BMEC中添加不同浓度的H2O2(0、100、200、400、600、800和1 000μmol/L)作用细胞6 h,收集细胞和培养液测定抗氧化指标,筛选使细胞发生氧化损伤的适宜H2O2作用浓度。试验一结果表明,600μmol/L H2O2作用细胞6 h,BMEC的存活率降低至79.79%。试验二结果表明,600~1 000μmol/L组与其他各组相比均显著降低了谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性,提高了丙二醛含量(P<0.05),但600、800和1 000μmol/L组之间差异不显著(P>0.10)。结果 提示,H2O2作用浓度为600μmol/L、作用时间为6 h,使BMEC产生了明显的氧化应激,可作为建立细胞氧化损伤模型时的适宜条件。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养研究进展

体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)常被用于研究乳成分的合成调控以及乳腺的生理代谢.近年来,随着越来越多永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立,其应用也更为广泛.本文综述了奶牛乳腺细胞系的种类和奶牛乳腺细胞体外培养的方法,为研究乳腺上皮细胞的功能及泌乳机制提供参考.     

Effect of Glycyl-tRNA Synthetase on Cell Proliferation of Bovine Mammary Epithelial Cells

Glycyl-tRNA synthetase is an important member of aminoacyl-tRNA synthetase family.However,the knowledge about expression and regulation mechanism of GlyRS in the development of bovine mammary gland is limited.To reveal the relationship among GlyRS and bovine mammary gland development and lactation,EdU immunofluorescence and flow cytometry were used to analyze the impact of GlyRS on the number of DNA and the influence of the cell cycle of BMEC,and the expression of Cyclin D1 of BMEC by Real-time PCR and Western blotting.The results showed that the DNA synthesis of BMEC,the numbers of cells in S and G2/M phase,and Cyclin D1 expression levels in BMEC were all increased after BMEC was transfected with a GlyRS overexpression vector,whereas all of the above indexes were reduced after BMEC was transfected with a shRNA targeting against GlyRS.This study revealed that GlyRS accelerates cell cycle transformation,increases the number of DNA synthesis by upregulating the expression of Cyclin D1,thereby promoting BMEC proliferation.     

甘氨酰tRNA合成酶对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响

甘氨酰tRNA合成酶(glycyl-tRNA synthetase,GlyRS)是重要的氨基酰tRNA合成酶(aminoacyl-tRNA synthetases,aaRSs)家族成员。目前,国内外关于GlyRS 在奶牛乳腺发育过程中表达及调节的研究鲜有报道。为了揭示GlyRS的表达与奶牛乳腺发育与泌乳之间的关系,本试验应用EdU免疫荧光法、流式细胞术检测GlyRS对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMEC)中DNA数目及细胞周期的影响,实时荧光定量PCR、Western blotting技术检测GlyRS对BMEC中Cyclin D1的表达影响。结果显示,GlyRS过表达时,细胞的DNA合成、处于S期和G2/M期的细胞数、细胞中Cyclin D1的表达均增加;GlyRS抑制后,细胞的DNA合成、处于S期和G2/M期的细胞数、细胞中Cyclin D1的表达均减少。表明GlyRS通过上调Cyclin D1的表达,加快细胞周期转换,增加DNA合成数目,从而促进BMEC增殖。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104、1×105和1×106个细胞/mL。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104～1×105个细胞/mL时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

山羊乳腺上皮细胞的分离、培养与超微结构观察

从山羊乳腺取部分组织进行细胞培养，并通过控时消化分离纯化山羊乳腺上皮细胞，建立了山羊乳腺上皮细胞系。结果表明：用含150U／mL Ⅰ型胶原酶和100U／mL透明质酸酶的混合液，37℃消化组织块4h，可得到大量的分散单细胞用于原代培养，该法是获得山羊乳腺组织单细胞的适宜方法；以含10％胎牛血清和双抗的RP-M11640或DEME／F12培养液为基础液，在培养液中添加氢化考的松、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、表皮生长因子(EGF)及胰岛素一转铁蛋白一硒钠(ITS)对山羊乳腺上皮细胞的生长具有较明显的促进作用。上皮细胞显微和超微结构显示：山羊乳腺上皮细胞在体外培养过程中可形成岛屿状单层聚集和类似圆顶状的结构；传代培养到第7代的细胞仍增殖旺盛，细胞内有丰富的脂滴和高尔基小泡，细胞分泌活动旺盛。     

牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的检测及核型分析

本试验用Western-blotting检测奶牛乳腺上皮细胞培养液中的β 酪蛋白，鉴定该细胞的生理功能是否正常；通过分析染色体数目及核型以鉴定体外培养的奶牛乳腺上皮细胞是否发生转化。结果显示：培养液中含有β 酪蛋白，说明该乳腺上皮细胞生理状况良好；染色体数目正常，染色体数目为60，核型与哺乳动物染色体图谱一致，说明该细胞系在体外培养条件下未发生转化。     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶＋0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异（P〉0.05...     

消化酶及胎牛血清对奶牛乳腺上皮细胞培养的影响

试验研究了不同浓度及组合消化酶对奶牛乳腺组织分离的影响以及不同FBS浓度培养基对奶牛乳腺上皮细胞纯化和生长的影响。试验结果表明,0.25%胰酶+0.20%Ⅱ胶原酶对组织块分离效果最好,乳腺上皮细胞生长最多,5%与10%浓度FBS对奶牛乳腺上皮细胞纯化效果最好,5%与10%浓度FBS对细胞生长没有明显的差异(P>0.05),但明显高于其他处理组(P<0.01)。