牛白细胞介素18成熟蛋白cDNA基因的克隆和表达

应用RT—PCR技术分别从脂多糖（LPS）活化的牛脾脏细胞和肺泡巨噬细胞中克隆到编码牛白细胞介素（bIL）18成熟蛋白的cDNA基因，其大小为480bp。将bIL-18克隆到pET32a（＋）质粒中，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析．得到了分子量为38ku的融合蛋白，该蛋白经纯化并复性后，具有诱导MDBK分泌IFN-γ的活性，并且可以刺激ConA活化的外周血单核细胞（PBMC）增殖。使用半定量RT—PCR对其mRNA的体内表达进行了测定，发现不论是否加入刺激剂，牛巨噬细胞都可以持续的表达IL-18 mRNA，但是被LPS活化的PBMC只有微弱表达，肝和脾细胞经LPS活化后也可以检测到IL-18 mRNA的表达，其水平明显高于PBMC，在不同细胞中表达的差异可能反映了其产生成熟IL-18的能力。     

鸭的类似鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

通过RT—PCR和DNA测序技术，克隆和测定了绍兴麻鸭的一种类似鸡白细胞介素2(IL-2)基因的核苷酸序列，并构建了该基因编码蛋白的三维结构分子模型。结果显示，绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸长度由748个碱基组成，编码产物为由140个氨基酸残基组成的多肽，编码产物中含有21个氨基酸残基组成的信号肽。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸及编码产物，与鸡和火鸡IL-2的一致性分别为71.4％～72．1％和55．0％～57．9％，与哺乳类等动物IL-2的一致性分别为22．1％～28．8％和14．3％～17．1％。对绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因蛋白编码产物的系统进化树分析表明，其编码产物与鸡和火鸡IL-2具有较远的亲缘关系。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物的三维结构，预测由4个α-螺旋结构和2个β折叠组成。这些研究结果预示。鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物，在生物学功能上与哺乳动物和其他禽类具有很大的差异。     

奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

根据GenBank发表的奶牛白细胞介素2(IL-2)基因序列,设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术扩增奶牛IL-2基因,琼脂糖电泳显示扩增出的片段约为477bp。回收片段,克隆入pMD18-T载体,经菌落PCR、酶切及重组质粒PCR鉴定,测序结果显示,克隆的奶牛IL-2基因与GenBank发表的奶牛IL-2基因序列同源性为98.7%。该序列与水牛和山羊的IL-2基因序列同源性最大,在95%以上;氨基酸和抗原性比较分析显示,奶牛的IL-2与山羊及水牛的IL-2在这两方面有较高的同源性。     

鸡白细胞介素15基因的克隆及序列分析

根据GenBank中所收录的鸡白细胞介素15(ChIL 15)的cDNA序列设计特异性引物,以经ConA刺激3 h的科宝鸡脾脏淋巴细胞的总RNA 为模板,用RT PCR 方法克隆获得了ChIL 15的cDNA。ChIL 15的cD NA全长655 bp,其中第84 位~644 位是该基因的阅读框(ORF),共编码187 个氨基酸。将所克隆的序列与已报道序列相比较,二者核苷酸的同源性为100%(655/655),所编码蛋白质的氨基酸序列同源性也为100%。     

鸡白细胞介素-17基因的克隆和序列分析

根据GenBank中收录的鸡白细胞介素-17（ChIL-17）基因的cDNA序列设计了1对特异性引物，以经ConA刺激3h的鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，用RT-PCR方法成功克隆了ChIL-17的cDNA。该cDNA全长725bp，其中第2～508位是该基因的阅读框（ORF），共编码169个氨基酸。与已报道的序列相比较，二者核苷酸序列的同源性为99．6％（722／725），共有3个碱基发生变异，其中有2个变异位于阅读框之内。DNAssit软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为100％。同时，以鸡脾淋巴细胞DNA为模板，用PCR方法首次扩增获得了ChIL-17的基因组DNA序列，经序列分析，其序列全长1934bp，由2个内含子和3个外显子组成，3个外显子分别位于第2～27、569～815和1484～1720bp处。     

藏猪白细胞介素-2基因的克隆及序列分析

将藏猪外周血淋巴细胞在伴刀豆球蛋白 A(Con A)的刺激下体外培养 70 h后 ,提取激活淋巴细胞总 RNA,应用RT- PCR技术扩增出藏猪淋巴细胞白细胞介素 - 2 c DNA (TPIL - 2 ) ,克隆到 p MD- T载体上并测序。测序结果显示 ,克隆的TPIL- 2 c DNA全长为 5 0 3个碱基 ,开放阅读框 (ORF)为 4 6 5个碱基 ,编码 15 4个氨基酸 ,分子量为 17.4 kd,等电点为 5 .38;疏水氨基酸 4 0 .3% ,亲水氨基酸 37.0 % ,碱性氨基酸 11% ,酸性氨基酸 11.7%。此 c DNA与报道猪的 IL - 2同源性为 10 0 % ,证实克隆到了藏猪白细胞介素 - 2基因 c DNA。     

犬白细胞介素18基因的克隆与序列分析

为研究犬白细胞介素18(IL-18)的生物学功能,从犬外周血中分离白细胞,经Con A刺激后,提取总RNA,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增犬IL-18基因,连接pMD19-T simple vector,转化DH5α感受态细胞,经双酶切鉴定,获得阳性重组质粒后进行序列分析。结果表明,获得的犬IL-18基因全长为582bp,编码氨基酸194个。将犬与GenBank中牛、猫、羊、猪、鼠、兔、狐、貉IL-18基因进行同源性比较,发现犬IL-18与红狐和貉IL-18的同源性最高,氨基酸序列同源性分别达96.4%、91.2%,与其他物种则存在较大种属差异。     

成华猪淋巴细胞白细胞介素—4基因的克隆及序列分析

将猪外周淋巴细胞进行体外培养，在伴刀豆球蛋白A（ConA）的刺激下培养48h，提取培养的淋巴细胞总RNA，应用RT－PCR扩增猪淋巴细胞白细胞介素－4（IL－4）基因，并克隆到pMD-T载体测序。测序结果表明，IL－4基因的cDNA长度为413bp，开放阅读框为402bp，编码134个氨基酸，分子量15.0ku，等电点8．24；与人和小鼠的IL－4基因编码的氨基酸序列的同源性分别为60％和42％。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

广西巴马小型猪IL-4和IL-10基因的克隆和序列分析

为研究猪白细胞介素4（IL-4）和白细胞介素10（IL-10）在机体免疫应答中的作用,从ConA刺激的巴马小型猪的外周血淋巴细胞提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出IL-4和IL-10基因,将其分别克隆到PMD18-T 载体上,进行序列分析.结果表明,克隆的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列与GenBank上登录的其它猪种的IL-4和IL-10基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.8%～100%、97.0%～99.3%和99.2%、97.7%.     

牛干扰素-γ基因的克隆、序列分析及表达研究

为了使干扰素-γ(interferon γ,IFN-γ)在牛结核等疾病的诊断和防制方面取得更有效的应用,试验采用RT-PCR法从云南本地黄牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增牛IFN-γ(BoIFN-γ)基因,测序并进行序列分析;然后亚克隆至pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。序列分析结果表明,克隆的IFN-γ基因与GenBank中荷斯坦牛IFN-γ序列同源性达99.60%。表达产物经SDS-PAGE分析,在大小约23 ku处可见目的蛋白表达条带,与预期结果一致;用ELISA检测,表达的蛋白具有明显的生物学活性,在菌体中的含量为244 ng/mL。本试验结果为牛IFN-γ蛋白的进一步研究和应用奠定了基础。     

牛ATGL基因的cDNA克隆、序列分析及组织表达研究

为了进一步研究牛ATGL基因的结构与功能,揭示该基因的组织特异性表达规律。本研究以秦川牛的脂肪组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR,对牛的脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)基因的cDNA进行克隆,并对其进行了生物信息学分析及组织表达研究。结果表明:牛ATGL基因编码区全长为1 461 bp,共编码486个氨基酸;牛ATGL基因与猪同源性最高(87.5%),其次是人(87.3%)、狗(86.8%)、小鼠(84.7%)和大鼠(82.4%);ATGL蛋白含有1个Patatin结构域;牛ATGL基因在脂肪和瘤胃中高丰度表达,在睾丸中没有检测到。ATGL基因在动物进化中比较保守,具有相似的生物学功能,该基因的表达具有组织特异性。     

白细胞介素18生物学作用及其在病毒感染中的表达调控

白细胞介素18（IL－18）作为一种能诱导产生IFN－γ的因子，在机体产生抗微生物免疫中起着重要作用。巨噬细胞是生物活性IL－18的主要来源，它们持续转录IL－18的mRNA并表达其前体蛋白。微生物感染可提高巨噬细胞中IL－18基因的表达水平，IL－18分泌的调节以IL－18前体蛋白翻译后的调节为主，而不是对转录活性进行调控。本文综述了IL－18的生物学特性，总结了IL－18促进炎症和免疫调节功能的最新知识，重点讨论病毒感染时巨噬细胞产生IL－18的Caspase依赖性调控。     

白来航鸡IL-18和GM-CSF基因克隆与序列分析

根据GenBank中鸡白细胞介素18(IL-18)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的序列设计2对特异引物,以白来航鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆白来航鸡IL-18和GM-CSF工基因并进行序列分析.测序结果表明,白来航鸡IL-18基因开放阅读框为597 bp,编码199个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡IL-18基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%.白来航鸡GM-CSF基因开放阅读框为435 bp,编码145个氨基酸;序列分析表明,所获得的白来航鸡GM-CSF基因与GenBank鸡GM-CSF的核苷酸同源性为99.3%～100%,氨基酸同源性为99.3%～100%,生物信息学分析表明,IL-18与GM-CSF基因编码的蛋白具有亲水性,都有很强的抗原性,IL-18共有2个潜在的N-糖基化位点,可能存在4个蛋白激酶C磷酸化位点,存在3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点;GM-CSF共有1个潜在的N-糖基化位点,可能存在1个蛋白激酶C磷酸化位点,存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点.     

重组牛白细胞介素-2生物活性单位的测定及其理化性质的分析

本研究对大肠杆菌表达的重组牛白细胞介素－２的生物活性单位进行了测定。以已标定的人白细胞介素－２为标准品,ＭＴＴ比色法测出重组牛白细胞介素－２的生物活性单位约为４×１０６ｕ／Ｌ菌液。同时,以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法测出表达的重组牛白细胞介素－２分子量约为１５．５ＫＤ。理化性质分析结果表明,重组牛白细胞介素－２生物活性酸碱适应范围约为２～１０;对胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用敏感,而对核酸酶的作用则不敏感;重组牛白细胞介素－２对温度变化敏感,表现为不耐高温。     

鲤鱼白细胞介素10基因组DNA克隆及序列分析

为获得鲤鱼白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)全长基因组序列,本研究利用鲤鱼IL-10全长cDNA序列(GenBank登录号:JX524550),通过在两端非编码区设计引物,以提取的鲤鱼脾脏基因组为模板,使用PCR方法成功获得鲤鱼IL-10全长基因组序列。鲤鱼IL-10基因组全长2176 bp,GenBank登录号为JX524551。将所获得的序列与其他物种IL-10基因组序列相比,结果发现都含有5个外显子,4个内含子,外显子在进化上相对保守,剪切位点都符合"gt......ag"规则;序列包含540 bp的开放阅读框,编码179个氨基酸,有2段典型的IL-10氨基酸信号基序。     

刚地弓形虫18S rDNA基因的克隆与序列分析

采用PCR方法从弓形虫RH株和CN株总DNA中分别扩增到18S rDNA基因，与pGEM-T easy vector连接，并进行DNA测序分析。结果表明，2个虫株均扩增出1745bp的片段，用DNAMAN软件对其与GenBank上2个虫株相应序列进行同源性比较，4个虫株的同源性为99．34％。刚地弓形虫虫株在不同宿主和不同区域上存在着一定的差异。