犬瘟热病毒贵州分离株N基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株N蛋白基因序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的N基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株N基因的ORF全长1572 bp,其编码氨基酸序列与国外Shuskiy株和01-2689株的同源性分别为98.9%和97.1%,与部分国内分离株同源性在95%以上,说明N蛋白是保守性较强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒上海株N蛋白编码基因的克隆与序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)核蛋白（N）基因序列，设计合成1对特异性引物，以CDV上海（SH）株的总RNA为模板，RT-PCR扩增N蛋白基因，并进行克隆与序列分析。结果显示：CDV SH株N蛋白基因序列与CDV TN株、 A75/17 株、2544/Han95株、98-2654 株、5804株、Onderstepoort疫苗株的同源性分别为98.9%、97.6%、96.7%、96.9%、96.6%、93.9%；编码氨基酸的同源性分别为99.0%、98.7%、98.1%、97.9%、97.9%、96.9%。推测N蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒A株N蛋白基因编码区的克隆与序列分析

本试验对犬瘟热病毒 ( CDV) A株 N蛋白基因编码区进行了克隆与序列分析。结果表明 :CDV A株 N蛋白基因编码区核苷酸序列与Onderstepoor株。 A75/ 1 7株及 2 544/ han95株的同源性分别为 97.5%、94%及 93 % ,编码氨基酸的同源性分别为 98%、97%和 96%。     

犬瘟热病毒SH株N蛋白基因序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,以CDV SH株的总RNA为模板,RT-PCR扩增N蛋白基因,并进行克隆与序列分析.结果显示:CDV SH株N蛋白基因序列与CDV TN株、 A75/17 株、2 544/Han95株、98～2 654 株、5 804株、Onderstepoort疫苗株的同源性分别为98.9%,97.6%,96.7%,96.9%,96.6%,93.9%;编码氨基酸的同源性分别为99.0%,98.7%,98.1%,97.9%,97.9%,96.9%.推测N蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白.     

犬瘟热病毒上海分离株M蛋白编码基因的克隆与序列分析

本研究以犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)上海分离株的总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV M蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,RT PCR扩增M蛋白基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV上海分离株M蛋白基因序列与CDV A75/17 株、Onderstepoort疫苗株等其它7株的同源性在95%以上;编码氨基酸的同源性也高于97%。推测M蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒N基因和M基因的克隆与序列分析

以从宠物临床上分离的犬瘟热病毒（canine distemper virus,CDV）总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV核蛋白（N）、基质膜蛋白（M）基因序列,分别设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增N、M蛋白编码基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,均扩增出预期大小的片段。扩增片段经核苷酸序列分析,N、M编码基因全长分别为1572、1008 bp,该CDV的N蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为93.9%、97.6%,编码氨基酸的同源性分别为96.9%、98.7%;M蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为94.5%、97.8%,编码氨基酸的同源性分别为97.9%、99.7%,这说明N、M蛋白均是保守性较强的结构蛋白,且同强毒株A75/17的亲缘关系要比Onder-stepoort疫苗株更近。     

犬瘟热病毒蓝狐分离株融合蛋白基因的序列分析

根据已发表的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)Onderstepoort株序列设计1对引物,RT-PCR法扩增出约1 000 bp的融合蛋白基因片段,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pMD18-T载体。序列分析表明CDV蓝狐分离株F蛋白基因片段由1 044 bp组成,编码348个氨基酸,与其它CDV25259株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、5804P株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.5%、94.1%、94.7%、94.2%、94.2%、97.6%和94.9%;氨基酸序列的同源性分别为98.6%、97.1%、98.0%、98.0%、98.3%、97.7%和98.6%;与其它CDV毒株相比,蓝狐分离株存在核苷酸缺失突变(1 030位～1 038位)和氨基酸缺失突变(344位～348位)。     

犬瘟热病毒SH株N蛋白基因序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,以CDV SH株的总RNA为模板,RT-PCR扩增N蛋白基因,并进行克隆与序列分析。结果显示:CDV SH株N蛋白基因序列与CDV TN株、A75/17株、2 544/Han95株、98~2 654株、5 804株、Onderstepoort疫苗株的同源性分别为98.9%,97.6%,96.7%,96.9%,96.6%,93.9%;编码氨基酸的同源性分别为99.0%,98.7%,98.1%,97.9%,97.9%,96.9%。推测N蛋白是一个保守性非常强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒N基因和M基因的克隆与序列分析

以从宠物临床上分离的犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)总RNA为模板,根据GenBank中已报道的CDV核蛋白（N）、基质膜蛋白（M）基因序列,分别设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增N、M蛋白编码基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,均扩增出预期大小的片段。扩增片段经核苷酸序列分析,N、M编码基因全长分别为1572、1008 bp,该CDV的N蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为93.9%、97.6%,编码氨基酸的同源性分别为96.9%、98.7%;M蛋白编码基因序列与Onderstepoort疫苗株、A75/17株的同源性分别为94.5%、97.8%,编码氨基酸的同源性分别为97.9%、99.7%,这说明N、M蛋白均是保守性较强的结构蛋白,且同强毒株A75/17的亲缘关系要比Onderstepoort疫苗株更近。     

犬瘟热病毒小熊猫株附着蛋白基因的序列分析

为了从基因水平上研究我们分离的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）小熊猫（ＬＰ）毒株与疫苗弱毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株的差别,本文对ＬＰ毒株附着蛋白（Ｈ）基因进行了序列测定,我们设计了４对引物,对ＬＰ株进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增,将扩增得到的４个阳性ＰＣＲ片段纯化后,直接进行测序,把所测序列拼接后,去掉侧翼的Ｆ基因和Ｌ基因序列,得到Ｈ蛋白的全基因序列,该基因全长为１９４６ｂｐ,开放阅读框架（ＯＲＦ）始于２１－２３     

犬瘟热病毒Guizhou株血凝素基因的克隆及序列分析

参照已发表的文献合成1对引物，以犬瘟热病毒Guizhou分离株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，RT-PCR扩增获得血凝素蛋白基因（H）901～1661位大小为761bp的片段，并将PCR扩增产物进行克隆和测序。将Guizhou株与GenBank数据库中的31株CDV及国内NanjingOP株的H基因序列进行同源性和系统发生树分析，发现Guizhou株的H基因部分序列与疫苗毒株Convac和Onderstpoort的同源性最低，只有90％；与日本野毒株Tanu96、KDK-1、Hmanatsu、Yanaka、UENO的同源性较高，为96％～98％；且与国内从大熊猫和小熊猫分离的野毒株GP和LP的同源性也较高，为98％和96％。系统发生树分析显示，Guizhou株与国内野毒株GP和LP，及日本的5个野毒株应属同一类，其中和GP株基因型最近，推测这些毒株间有更近的共同祖先。因此怀疑该病毒较适应于野生动物，且在我国某些地区的野生动物中可能存在自然疫源性传播。     

水貂犬瘟热病毒分离鉴定及其H基因序列分析

为了解山东地区水貂犬瘟热病毒(CDV)遗传变异特征,采集水貂养殖场的发病水貂病料,通过RT-PCR鉴定为CDV阳性,将阳性病料接种Vero/Dog SLAM细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光、电镜负染、测序等方法鉴定,得到4株犬瘟热病毒,分别命名为WD1株、WD2株、WX1株和WX2株。分离株H基因测序结果显示,WD1株、WD2株、WX1株均为Asia-Ⅰ型,其中WD1和WD2与近几年仅在水貂和狐狸养殖场流行的新犬瘟热毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.5%~99.2%和97%~99%;WX-1型与国内犬源HL001株的同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.6%和99.5%;WX2与疫苗株同属于一个分支,与疫苗毒Lederle株核苷酸和氨基酸序列同源性高达99.5%和98.8%。结果表明,水貂养殖场存在多株犬瘟热病毒混合感染的情况,提醒养殖场应注意防控,该结果也为犬瘟热病毒分子流行病学积累了资料。     

犬瘟热病毒野毒株H蛋白基因的序列分析

对引起长春某犬场犬死亡的犬瘟热病毒（ Ｃ Ｄ Ｖ）野毒株（ Ｌ Ｉ Ｕ）附着或血凝蛋白（ Ｈ）基因进行了全基因序列测定,并与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株作了比较。用 ４ 对引物对 Ｌ Ｉ Ｕ 株进行了 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增得到的 ４ 个阳性 Ｐ Ｃ Ｒ 片段纯化后直接测序。将所测序列拼接后,去掉侧翼的 Ｆ 基因和 Ｌ 基因序列,得到了 Ｈ蛋白的全基因序列。该基因全长为 １ ９４６ ｂｐ,开放阅读框架（ Ｏ Ｒ Ｆ）始于 ２１～２３ 位的 Ａ Ｔ Ｇ,终止于 １ ８４２～１ ８４４位的 Ｔ Ｇ Ａ,编码 ６０７ 个氨基酸。将 Ｌ Ｉ Ｕ 毒株与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株进行比较,二者 Ｈ 基因核苷酸序列的同源性为 ９１．７％ ,推导的 Ｈ 蛋白氨基酸序列的同源性为 ９０．２％ 。 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株的 Ｈ 蛋白潜在的 Ｎ 联糖基化位点为 ４ 个,而 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白为 ８ 个。糖基化位点的不同可能对 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白的抗原性产生影响。２ 个毒株 Ｈ 蛋白的半胱氨酸残基数目均为 １２ 个,且位置是保守的;疏水性有一定的不同,但推测的穿膜区位置是相同的,位于 ３５～５５ 位氨基酸之间。     

一株水貂犬瘟热病毒的分离与鉴定

为寻找免疫失败的原因,有效防治犬瘟热的流行,对临床一水貂犬瘟热疑似病例,取其肝、脾、脑等组织研磨后接种Vero和BHK细胞分离病毒,并对分离毒株进行一系列鉴定。通过电镜观察,发现了大小约150 nm的副黏病毒样粒子。结果表明,分离株对鹅、鸡、小鼠、家兔、山羊、猪红细胞均无凝集性,该分离株的毒价TCID50为10-4.87;分离株病毒对乙醚、氯仿敏感,病毒的核酸型为RNA。经间接免疫荧光试验,接种病毒的BHK细胞出现特异性的亮绿色荧光。对分离株和对照毒株分别提取RNA进行RT-PCR扩增,最后得到与预期扩增片段(294 bp)相符的核酸电泳带,充分证明分离病毒为犬瘟热病毒。     

基因序列分析确诊大熊猫的犬瘟热病毒感染

直接从死亡大熊猫肝脏提取细胞总 Ｒ Ｎ Ａ,经反转录后用犬瘟热病毒的 １ 对引物扩增出了约 ３２０ ｂｐ 的片段。此产物经纯化、序列分析表明,其片段 ２ 个引物间长度为 ２８１ ｂｐ,与预计片段大小相同。此毒株在核苷酸和氨基酸水平与北京犬等 ４ 个野毒株、哈尔滨犬野毒株、某疫苗弱毒株、 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 弱毒株和海豹瘟热病毒 ２ 型毒 株的 同源 性分 别为 ９２２％ 和 ９８９％ 、９２５％ 和 ９８９％ 、９１５％ 和 ９４６％ 、９２９％ 和 ９８９％ 、９８２％ 和 １００％ 。这样就进一步确定了大熊猫的犬瘟热病毒感染。