2株H5N1亚型禽流感病毒人工感染鸭的组织病理学观察

鸭经肌肉接种禽流感病毒A/duck/Guangdong/185/2004（H5N1）和A/duck/Guangdong/221/2004（H5N1）后,2周内未见死亡,但具有一些显微和超微病理学变化,主要表现为呼吸道、消化道黏膜受损,心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脑等器官一定程度的充血、淤血、出血、水肿及实质细胞变性、坏死和炎症等。     

一株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的组织病理学观察

鸭静脉接种或经眼-鼻-口腔-泄殖腔接种禽流感病毒A／duck／Guangdong／220／2004（H5N1）后,全身多数脏器充血、淤血、出血,血栓形成、组织水肿,以及心、肝、脾、肺、肾、胰、脑、胸腺、法氏囊等许多器官的实质细胞发生坏死或凋亡;主要表现为血管炎、坏死性胰腺炎、萎缩性坏死性胸腺炎和法氏囊炎、脾炎、气管炎、出血性支气管间质性肺炎、病毒性心肌炎、非化脓性脑炎、局灶性病毒性肝炎、溃疡性肠炎、肾小管间质性肾炎和系膜细胞增生性肾小球肾炎等。结果显示,该病毒的致病机制与细胞坏死和细胞凋亡有关,而鸭多脏器严重的病理损伤是其死亡的原因。     

1株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的细胞凋亡观察

TUNEL染色法和透射电镜观察表明,鸭静脉接种或眼-鼻-口腔-泄殖腔混合接种高致病力禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004(H5N1)后,心、肝、脾、肺、肾、胰、肠、脑、胸腺和法氏囊均可发生细胞凋亡.其中,凋亡主要发生在胰腺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞、肝细胞和肠黏膜上皮细胞;也有少量神经元、神经胶质细胞、心肌细胞、呼吸毛细管上皮细胞,胸腺、脾脏和法氏囊淋巴细胞发生凋亡.     

一株天鹅源H5N1亚型禽流感病毒的分离鉴定

2004年从广东某地送检的病死天鹅肺组织中分离到1株禽流感病毒,用血凝抑制试验(HI)、聚合酶链反应(PCR)、基因测序等对其进行了亚型鉴定。结果表明,此分离株具有血凝活性,且H5亚型禽流感病毒标准阳性血清能对其产生特异性抑制作用;分别用针对禽流感病毒M基因、H5亚型禽流感病毒HA基因、N1亚型禽流感病毒NA基因特异性引物对该分离株进行PCR扩增,均获得特异性目的片段;测序及BLAST分析表明HA基因与A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003(H5N1)的HA基因同源性为98%;NA基因与A/swine/Fujian/1/2003(H5N1)的NA基因同源性为98%,由此该分离株鉴定为H5N1亚型禽流感病毒,按照国际流感病毒系统命名原则将该病毒株暂命名为A/Swan/Guangdong/197/2004。     

鸭源H5N5和H5N1亚型禽流感病毒BALB/c鼠感染试验

比较鸭源H5N5亚型禽流感病毒(A/Duck/Changchun/01/2010)和鸭源H5N1亚型禽流感病毒(A/Duck/Liaoning/N/2011)对BALB/c鼠的致病性。以106EID50/50μL剂量鼻腔感染6周龄BALB/c鼠,攻毒后3,5,7,10,14 d取小鼠的肺、脑和肝脏,处理后接种10日龄SPF鸡胚做病毒回收试验,取死亡鸡胚的尿囊液进行RT-PCR检测;分别取接种病毒后5 d小鼠的脑、肝脏、肺脏、脾脏、肾脏进行病理组织学检测。结果显示,小鼠接种H5N5和H5N1亚型禽流感病毒后,均无明显的临床症状,肝脏中分别于接种后3,5 d分离到病毒,肺脏中于接种后5 d分离到病毒,脾脏、肾脏和粪便中均未分离到病毒。病理组织学检测发现,病毒对小鼠的脏器组织产生了不同程度的病理损伤,以肺脏、脑和肝脏较为明显,且H5N1亚型禽流感病毒引起小鼠脑和肝脏的病理损伤比H5N5亚型更严重。这表明2株鸭源禽流感病毒对小鼠均有一定的致病性,且H5N1亚型强于H5N5亚型。     

2株H5N1亚型禽流感病毒人工感染鸭的11项血液生化指标测定

鸭肌肉接种禽流感病毒A/duck/Guangdong/185/2004（H5N1）和A/duck/Guangdong/221/2004（H5N1）后,血清中的丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、总蛋白、肌酐、总胆固醇、钙和磷明显升高;葡萄糖和甘油三酯明显降低;白蛋白表现为先下降后升高的变化趋势。作者认为,检测这些血液生化指标对于诊断禽流感具有一定的参考价值。     

H5N1亚型禽流感病毒进化的研究进展

H5N1亚型禽流感病毒是重要的人兽共患病病原,其基因组为分节段的负股单链RNA,这种特殊的基因组结构使得流感病毒的进化机制跟其他病毒有所不同。本文对流感病毒的进化机制、H5N1亚型禽流感病毒的进化规律和生物信息学在流感病毒进化中应用等方面的研究进展予以综述。     

一株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的18项血液生化指标测定

鸭接种高致病力禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004（H5N1）后,血清中的丙氨酸氨基转移酶（谷丙转氨酶）、天门冬氨酸氨基转移酶（谷草转氨酶）、γ-谷氨酰基转移酶、肌酸激酶和乳酸脱氢酶明显升高;碱性磷酸酶明显下降;α-淀粉酶先升高后下降;总蛋白、球蛋白、尿素氮、胆固醇、钙和磷轻微升高;白蛋白、肌酐、葡萄糖、甘油三酯和尿酸轻微下降。作者认为,检查这些血液生化指标的变化,对于诊断禽流感具有一定意义。     

1株H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的抗原定位观察

通过对鸭静脉接种或眼-鼻-口腔-泄殖腔接种禽流感病毒A/duck/Guangdong/220/2004(H5N1)后,采用免疫组织化学方法检查病毒核蛋白抗原,探讨了该病毒在组织器官中的定位与分布.结果表明,病毒核蛋白抗原主要存在于鸭的心肌细胞、肝细胞、枯否氏细胞、胰腺泡上皮细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和血液吞噬性自细胞;在气管和支气管黏膜上皮,脑组织,肠黏膜上皮,胸腺、法氏囊、脾脏和肺脏的巨噬细胞或组织细胞以及坏死的细胞碎片中也可检查到少量病毒核蛋白抗原;而在食管、胃、睾丸、卵巢、甲状腺、肾上腺、哈德氏腺、骨骼肌等未检查到该抗原.     

H5N1亚型禽流感病毒对鸭的致病性研究

为评估H5N1亚型禽流感病毒(AIV)在实验室环境下对鸭的致病力,本研究以无特殊病原(SPF)鸭为模型,对我国近年分离的7株病毒进行了致病力分析。结果发现其中4株病毒对鸭致死率为100%,2株病毒对鸭的致死率分别为60%和80%,另外1株病毒,A/goose/Hubei/51/05(GS/HB/51/05),对鸭无致病力。本研究还发现,与高致病力毒株一样,GS/HB/51/05也可在鸭体内呈全身性复制,并且可通过喉头和泻殖腔向外排泄。我们推测GS/HB/51/05可能是中国南方出现的其他对鸭呈高致病力的H5N1病毒的祖先,对这些病毒的系统研究,可揭示H5N1亚型AIV对鸭的致病力遗传机制。     

H5N1亚型禽流感病毒NP基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒NP基因序列设计、合成PCR克隆引物。自H5N1阳性病料中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶,经PCR扩增NP基因,采用Invitrogen定向表达系统进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组NP蛋白,分子质量约66.0ku。采用单克隆抗体和阳性血清经ELISA、免疫印迹分析重组蛋白的免疫反应性。结果表明:所获得的重组NP蛋白在ELISA分析中均能与阳性血清和单克隆抗体发生特异性结合,但在免疫印迹分析中仅与阳性血清发生特异性结合。     

H5N1禽流感病毒感染小鼠后内参基因的筛选

本研究旨在评定H5N1禽流感病毒(H5N1 avian influenza virus,H5N1 AIV)感染小鼠后,脾脏组织中6个候选内参基因酪氨酸3/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein,Ywhaz)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1,Hprt1)、琥珀酸脱氢酶A亚基(succinate dehydrogenase flavoprotein subunit,Sdha)、β-肌动蛋白(β-actin,Actb)、肽基脯氨酰异构酶A(peptidyl prolyl isomerase A,Ppia)和18S核糖体RNA(18S ribosomal RNA,18S rRNA)的稳定性。通过H5N1 AIV强毒株A/DK/GD/378/08感染小鼠,采用Real-time PCR方法分别于12、24、48、72、96、120和144 h检测感染组与对照组中6个候选内参基因的表达水平,然后用Genorm软件对内参的稳定性进行评价。结果表明,正常小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ywhaz/Hprt、Sdha、Actb、Ppia、18S rRNA;H5N1 AIV感染的小鼠脾脏组织中6个内参基因稳定度由高到低分别为Ppia/Sdha、18S rRNA、Hprt、Ywhaz、Actb;综合评价正常和H5N1 AIV感染后小鼠脾脏组织中6个内参基因的表达稳定度由高到低分别为Sdha/Hprt1、Ywhaz、Ppia、Actb、18S rRNA。因此,小鼠脾脏组织中Ppia和Sdha是研究H5N1 AIV在机体中复制时最理想的2个内参基因;Sdha和Hprt1则是在研究H5N1 AIV与机体相互作用时最理想的2个内参基因。     

H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状及应用前景

H5N1亚型禽流感病毒是目前发现的禽流感病毒中感染性最强、致死率最高、流行最广的一类病毒,该病毒已在世界上多个国家发生流行,给禽类养殖业带来了巨大的经济损失。当前针对该病尚无高效特异的治疗方法,进行疫苗的接种是目前最为有效的预防措施和关键环节。因此,研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为当前禽流感防制工作的热点之一,且取得了大量的研究成果。作者从禽流感病毒灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗和RNAi技术应用等方面对H5N1亚型禽流感病毒疫苗的研究现状作一综述,归纳出该领域中存在的问题和不足,并对禽流感疫苗的应用前景作一展望,以期为深入进行禽流感的防制研究提供参考。     

Pathogenicity of a Strain of H5N6 Subtype Avian Influenza Virus in Ducks and Mice

To investigate the pathogenicity of A/Hero/Guangdong/C1/2013(H5N6), an AIV strain isolated from Heron on ducks and mice, pathogenicity of this new virus strain and changing of histopathology as well as a preliminary study on its biological characteristics were studied by virus challenges test via intranasal and eye-drop and in chicken via jugular vein injection.Results showed that the EID₅₀ of this strain of virus was 10^-8.16/0.1 mL in embryonated chicken eggs and the intravenous inoculation of pathogenic index (IVPI) was 2.76.In ducks and mice, the 50% lethal doses (LD₅₀) of it were determined to be 10^-4.0/0.2 mL and 10^-4.67/0.05 mL, respectively.Symptoms of infection included loss of appetite, depression, swollen head and tears after being infected with 10⁶ EID₅₀ per duck by intranasal and eye-drop administration.Most of ducks died 4 to 7 days post-infection, liver, lung and kidney still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Anatomy showed symptoms of pericardial effusion, pulmonary congestion and kidney enlargement, while pathological section showed pathological change like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, liver, kidney and spleen.Mice developed symptoms of infection like loss of appetite, depression, shaggy coat and ruffled coat after being infected with 5×10⁵ EID₅₀ per mouse by intranasal and eye-drop administration.Most of the infected mice died 5 to 7 days post-infection and only liver still eliminated toxicants at day 7 post-infection.Although organ anatomy showed no obvious pathological changes, pathological section showed pathological changes like karyopycnosis and inflammatory cell infiltration in heart, kidney and lung.Our research demonstrated that this H5N6 subtype AIV had a strong pathogenicity and could be defined as a highly pathogenic AIV strain as its IVPI was greater than 1.2.Our work laid a theory foundation for study, prevention and control of H5N6 subtype AIV.     

一株H5N6亚型禽流感病毒对鸭和小鼠的致病性研究

为了研究一株从鹭中分离到的禽流感病毒(AIV)A/Heron/Guangdong/C1/2013(H5N6)对鸭和小鼠的致病力,本研究通过对鸭和小鼠滴鼻点眼和鸡的颈静脉注射进行攻毒试验,观察其致病力和组织病理学等变化,对其生物学特性进行初步研究。结果显示,该毒株的鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.16/0.1 mL,静脉接种致病指数(IVPI)为2.76。对鸭的半数致死量(LD₅₀)为10^-4.0/0.2 mL,对小鼠的LD₅₀为10^-4.67/0.05 mL。以10⁶ EID₅₀/只滴鼻点眼感染鸭,主要表现为食欲下降、精神萎靡、肿头流泪等症状,大多数鸭在感染后4~7 d死亡,感染后第7 天肝脏、肺脏、肾脏仍在排毒,解剖可见心包积液、肺脏淤血、肾脏肿大等症状,病理切片可见心脏、肝脏、脾脏、肾脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。以5×10⁵ EID₅₀/只滴鼻感染小鼠,主要表现为食欲下降、精神萎靡、被毛粗乱、聚堆等症状,大部分小鼠在感染后5~7 d死亡,第7天时只有肺脏仍在排毒,各脏器解剖学病变不明显,病理切片可见心脏、肾脏、肺脏炎性细胞浸润,脑细胞核固缩等病变。研究结果表明,该H5N6亚型AIV毒株对鸭和小鼠具有很强的致病力,IVPI大于1.2,为高致病性AIV,本研究为H5N6亚型AIV研究和防控提供了理论基础。     

鸡胚中H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

将来自有产蛋下降的肉用型父母代种鸡群的种蛋孵化,每日观察鸡胚死亡情况。在孵化的50个鸡胚中9日龄时开始死亡1个,尿囊液无血凝性,盲传一代后,鸡胚尿囊液有血凝性。在HI试验中,对H9亚型禽流感病毒(AIV)单因子血清在1∶26稀释度时呈现血凝抑制活性,对新城疫病毒(NDV)和H5亚型AIV单因子血清不呈血凝抑制活性,由此确定为低致病性禽流感病毒,命名为ZKH90901。对该毒株进行HA和NA基因扩增克隆测序,把获得的HA和NA基因与已经发表的H9N2毒株的相应序列比较,结果表明该毒株确实为H9N2亚型禽流感病毒,HA基因的裂解位点序列为KSGR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒H9N2蛋白裂解位点的分子特征,仍属于低致病力毒株。从鸡胚中分离到H9N2亚型禽流感病毒在国内尚未见报道。