鹅细小病毒的分离鉴定及生物学特性研究

鹅细小病毒病又称小鹅瘟,是由鹅细小病毒(GPV)引起的.笔者对黑龙江省某养鹅场送检的疑似鹅细小病毒病病例的肝、脾组织进行病毒分离,并对病毒的增殖特性、形态学观察、血清学反应以及病毒对12日龄鹅胚的致病性及半数致死量、接种试验和免疫原性进行研究,现将结果报道如下.     

鹅细小病毒广西株的分离鉴定

将广西某养鹅场5日龄发病的雏鹅肝脾处理后接种于10日龄的鹅胚,分离到一株病毒,对死胚收集的尿囊液进行荧光PCR确诊后,对其VP3基因进行扩增测序,通过与GDFSH株(Guangdong)、82-0308株(Taiwan)、HLJ01株(Heilongjiang)和HBZF07株(Hebei)VP3基因序列分析,核苷酸序列同源性在96.2%以上,从分子水平上鉴定该分离株是鹅细小病毒.     

鹅细小病毒HG5/82株的分离鉴定及生物学特性的研究

本研究通过对1982年黑龙江某鹅场发生的鹅细小病毒病疑似病例的肝病变组织病毒分离,进行回顾性研究.将肝脏加PBS研磨后,-70℃/37℃反复冻融三次,除菌过滤后接种12日龄鹅胚.发现病毒对鹅胚的致死时间为5～6 d,胚体体表有轻微出血点.鹅胚尿囊液经磷钨酸染色,可见具有典型特征的细小病毒粒子.将该病毒尿囊液在12日龄鹅胚中连续传16代,随着传代次数的增加,胚体多集中在3～4 d死亡.病毒传至第三代时死亡胚体头、颈、背部出现较为严重的出血点,体表有水肿.第五代病毒尿囊液(命名为HG5/82)对12日龄鹅胚的ELD50为10-5.92/0.1 mL.将20只12日龄雏鹅分为三个试验组和一个阴性对照组,各组分别接种鹅胚尿囊液104.92ELDso、103.92ELD50、102.92ELD50及生理盐水,发现雏鹅接种HG5/82后4 d出现轻微腹泻,随后恢复正常.用套式PCR检测雏鹅肛拭子病毒的体外排放情况.发现三个试验组在接种病毒后1～20 d用套式PCR均可检测到病毒.对照组及试验组接种后20～56d没有检测到病毒.将套式PCR产物进行序列测定并于参考毒株进行比较,表明该序列具有GPV相应区域的共同分子特征,与GPV参考毒株B的相应序列同源性达93.6%.本研究结果表明,该分离毒株为典型的鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV),对雏鹅的致病力较弱.     

鹅细小病毒SS/10株的分离鉴定及生物学特性研究

2010年从佛山市某专业户送检的雏鹅肝组织中分离到1株鹅细小病毒(命名为SS/10株),并对其生物学特性进行了研究。该毒株的番鸭胚半数致死量为10^-4.6/0.3 mL,动物回归试验显示其对10日龄雏鹅没有致死性,从组织切片观察肠、肝脏、肾脏和脑组织均有明显的病理变化。对该毒株测序分析结果发现,其VP1、VP2和VP3基因与GenBank收录的番鸭分离株DY株的同源性较其他参考毒株(鹅分离株)的同源性低,NS1和NS2基因的同源性没有这种差异;其VP3基因与82-0321V,VG32/1和标准株B株在同一分支上,与82-0321V亲缘关系最近,与番鸭细小病毒GD株亲缘关系最远;其VP3基因与B株相比少了505-507位的糖基化位点NRT。     

鹅细小病毒强毒株的分离鉴定与遗传进化分析

为了了解齐齐哈尔地区鹅细小病毒（GPV）现地强毒株的流行及抗原变异情况,试验从齐齐哈尔龙江县某养殖场采集疑似小鹅瘟病死雏鹅的肝脾病料进行病毒分离培养,对获得的疑似尿囊液进行PCR检测、血凝性检测、动物回归试验及VP3基因序列分析。结果表明,分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅在96～144 h内全部死亡;VP3基因PCR扩增条带大约为1 600 bp,与目的条带大小相符;对其进行序列分析,判定该分离株为鹅细小病毒毒株,与我室之前分离鉴定的鹅细小病毒HH10强毒株核苷酸同源性为98.17%,与标准B株核苷酸同源性为97.13%。说明鹅细小病毒基因保守。     

鹅细小病毒野毒株分离鉴定及致病力试验

从小鹅瘟疑似病料中分离出1株病毒,经电镜观察、血清保护试验鉴定为鹅细小病毒。动物回归试验表明,该病毒所致疾病的潜伏期为8d,病程为1~3 d,病死率达100%,对雏鹅半数致死量(LD50)为0.2 mL 10-5稀释的病毒液。     

鹅细小病毒BC1105株的分离鉴定

2011年5月中旬在吉林省白城地区的某养鹅场疑似小鹅瘟病死雏鹅的肾脏、肝脏、脑和脾脏组织中分离到1株病毒,选用未免疫小鹅瘟疫苗的健康母鹅所产的14日龄鹅胚,进行鹅胚接种试验,连续传代、血凝试验、琼脂扩散试验、电镜观察、PCR鉴定和动物回归试验,初步确定该病毒为鹅细小病毒,命名为BC1105株。     

鹅细小病毒吉林株的分离鉴定及其全基因序列分析

从患病鹅的病料中分离鉴定了2株鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为CH株和LS株。参考NCBI中多株GPV全基因序列,分段设计5对引物,对分离株的全基因序列进行PCR扩增、测序、拼接,并使用生物学软件对全基因序列进行比对和分析。遗传进化分析显示,CH株与LS株处于同一分支且相邻,表明具有较近的亲缘关系。由此推测,两株病毒可能起源于同一原始毒株。     

1株鹅细小病毒的分离鉴定

2004年3月以来，辽宁省部分地区雏鹅，出现下痢、口吐黏液、采食量减少等症状，个别鹅出现转脖、抽搐的情况。发病后的前4天曾经用过庆大霉素治疗，但没有效果。发病鹅表现为下痢、采食量减少，没有出现神经症状。肠浆膜呈橘黄色，小肠中后段膨大增粗，肠壁变薄，没有凝固性栓子。肝脏肿大，胆囊明显膨大，心肌颜色变淡，肾脏肿胀。为查明原因，笔者对发病的雏鹅进行病毒的分离与鉴定工作，通过电镜观察、琼脂扩散试验、病毒中和试验、抗血清保护试验，证实获得1株鹅细小病毒。经鹅胚接种、雏鹅攻毒试验，证实所分离的病毒具有较强的致病性。     

新型鹅星状病毒现地株的分离鉴定

为了解齐齐哈尔地区新型鹅星状病毒（Goose Astrovirus,GAstV）的流行情况,本试验采用从查哈阳农场某养殖场采集的疑似新型鹅星状病毒感染致死的雏鹅肝脾病料,进行病毒分离培养,对获得的病毒尿囊液进行RT-PCR检测、病毒半数致死量测定、血凝性检测及动物回归试验。结果表明：分离到的病毒株能使12日龄鹅胚在144 h内死亡;测定病毒的半数致死量（EID50）为10～3.5;血凝性检测未检测出血凝价;动物回归试验,可复制该病,致使5日龄雏鹅发病死亡;ORF1b基因R T-PCR扩增条带大约为210 bp,与目的条带大小相符;对其进行核苷酸序列比对,与在NCBI上已发表的新型鹅星状病毒核苷酸同源性高达99.64%。说明该分离株为新型鹅星状病毒毒株。     

一株GPV的分离鉴定及致病性研究

为了确定导致吉林省某地区10日龄雏鹅发病的病原,从病死雏鹅的肝脏中分离到一株病毒,根据病毒的电镜照片,动物回归试验及PCR鉴定,确定为鹅细小病毒。PCR产物测序后经BLAST比对显示,分离毒株与NCBI收录的GPVVP3基因同源性均在92％以上,与GPV／CH／HLJ02／08VP3基因的同源性最高,达99％。致病性研究表明,分离株的ELD50为10^-6.5／0．2mL,毒力较强,且该毒株能被GPV标准血清所中和。     

鸡传染性法氏囊病（B87株）组织毒液生产工艺探讨

通过计算ELD50,将已知效价的鸡传染性法氏囊病(B87株)生产种毒分几个滴度进行稀释,分别接种SPF鸡胚,结果各组鸡胚随病毒接种量的提高,高峰期死亡时间逐渐靠前,高峰期死亡率也逐渐增加,抗原效价也逐渐提高,抗原产量也有明显变化,病毒滴度以102.0 ELD50/0.1mL接种鸡胚更合适.     

一株猪链球菌8型菌株的分离鉴定及其生物学特性研究

为明确天津市某猪场保育猪疑似发生猪链球菌病的病原菌及其致病力等生物学特性,将猪场一头发病猪扑杀,无菌采集病料于哥伦比亚血琼脂平板上划线培养,对分离的疑似菌株进行形态学观察、生化试验、16S rDNA序列分析和血清型鉴定,确定分离菌株为猪链球菌8型,命名为TJS31.药敏试验结果显示,TJS31株对8种受试药物耐药,4种...     

一株干酪乳杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

本研究旨在分离既能用于微生态制剂又能用于青贮饲料发酵剂的优良乳酸菌,采集规模化牛场青贮饲料,取梯度稀释液涂布MRS平板,进行厌氧培养,筛选优势菌株,观察其菌落形态,并进行生化试验和特异性PCR鉴定。研究自筛乳酸菌的生长曲线、产酸曲线、培养温度及培养基初始pH对菌株生长的影响,并研究其抑菌特性、药物敏感性和安全性。试验筛选到1株菌落形态圆形、边缘整齐、表面光滑、乳白色、镜检为革兰氏阳性的无芽孢杆菌。生化结果显示,分离菌株可厌氧生长,运动性试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验结果均为阴性,15种糖醇发酵试验结果符合干酪乳杆菌生化特征。用干酪乳酸杆菌特异性引物对菌株进行PCR鉴定,琼脂糖凝胶电泳结果显示在727 bp处出现特异性扩增条带,与生化鉴定结果相符,将分离菌株命名为RS1。RS1在0~4 h时发酵液pH变化不明显,处于生长延迟期;4~16 h时发酵液pH下降较快,进入对数生长期;16~36 h时发酵液pH下降缓慢,进入稳定期。RS1在培养温度为20~50 ℃范围内均能生长,适宜生长温度为25~40 ℃;在培养液初始pH 1.0~9.0条件下均能生长,最适pH为6.0~8.0;对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为23 mm,对大肠杆菌的抑菌圈直径为17 mm;对恩诺沙星和头孢他啶耐药;经14 d灌服小鼠生长状况良好。上述结果表明,本试验筛选到的干酪乳杆菌RS1安全、无致病性,在微生态制剂及生物饲料添加剂领域具有潜在的开发价值。     

小鹅瘟病毒的分离鉴定与临床病变观察

从患病雏鹅的病料样本中分离鉴定出一株小鹅瘟野毒。采用鹅胚扩增病毒。以琼脂扩散试验从感染鹅胚尿囊液中检出小鹅瘟病毒抗原,用感染鹅胚尿囊液人工接种8日龄健康雏鹅,雏鹅表现出典型的小鹅瘟临床症状和剖检特征。     

1株鲤鱼源植物乳杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

【目的】筛选具有优良益生特性的鲤源乳酸菌作为水产养殖用微生态制剂候选菌株。【方法】以鲤鱼肠道内容物及黏膜为菌株的分离来源,采用MRS培养基进行菌株分离纯化,经16S rRNA测序鉴定后,对分离菌株生长特性、产酸能力、耐酸、耐胆盐、抑菌特性、药物敏感性及安全性等生物学特性进行分析。【结果】试验成功分离到1株植物乳杆菌,将其命名为YY001,该分离株在MRS培养基上菌落形态为圆形、表面光滑、边缘整齐、呈乳白色,革兰氏染色为阳性、无芽孢、两端钝圆的短小杆菌;4 h后进入对数期生长,12 h后生长达到稳定期;具有较强的产酸能力,产酸曲线显示,0~12 h pH迅速下降,培养16 h的菌液pH达3.8;在pH 3.0和0.3%胆盐的条件下具有一定耐受性;该分离株对水产常见致病菌柱状黄杆菌、维气氏单胞菌和嗜水气单胞菌均具抑菌效果,且对柱状黄杆菌的抑菌效果最显著,抑菌圈直径达34.19 mm;药物敏感性试验结果显示,分离株对卡那霉素、链霉素和万古霉素耐药;每天一次连续1周灌胃10⁸CFU分离菌株对小鼠无毒害作用。【结论】本研究分离到的菌株YY001具有优良的生物学特性,可作为水产养殖用微生态制剂候选菌株,为后续制备鲤鱼用微生态制剂奠定基础。     

伪狂犬病弱毒株的分离鉴定及生物学特性的研究

在流行病学调查中分离到1株病毒,经鉴定为伪狂犬病弱毒株,定名为F971株。分离病毒经克隆纯化后测得其毒价为10^7.59TCID50/ml,通过细胞中和试验表明分离病毒能也有效地被猪伪狂犬病毒闽A株阳性血清中和。病毒在电镜下可以清楚地观察到囊膜及外周纤突。分离株对3日龄乳鼠有一定的致病力,但对家兔、3日龄乳猪及妊娠母猪都有很高的安全性。用不同的剂量10^0、10^-1、10^-2肌肉注射3日龄乳猪后14天用10^5.7TCID50伪狂犬病强毒攻击,所有试验仔猪均得到保护。用分离株免疫母猪,其后代可获高滴度的母源抗体,15日龄的仔猪能抵御10^5.7TCID50强毒的攻击。用ELISA普查试剂盒测定免疫猪抗体,结果均为阳性,而用g^1-ELISA试剂盒测定抗体时,结果均为阴性。证明分离株具有缺损g^1糖蛋白的特性。综合上述特性,确定F971为1株g^1糖蛋白缺损的猪伪狂犬病弱毒株。     

牛源荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

探明一起牛运输热的病原及生物学特性,本研究采集病死牛心血、肺脏,对其进行细菌分离、生化试验和PCR鉴定,并对分离株进行毒力基因检测、致病性研究。结果显示,该分离菌为革兰氏阴性菌,呈球状或短杆状、两端钝圆、两极浓染。生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、木糖等碳水化合物,不发酵脲酶和吲哚,产生少量酸而不产气,符合溶血性曼氏杆菌的生化特性。PCR鉴定为荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌,并完成了毒力基因的检测。结果表明,引起该批牛运输热的病原为携带毒力基因的荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌,本研究结果为进一步研究溶血性曼氏杆菌的致病机制、防控措施等提供参考。     

广东省1株猪2型链球菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

为确诊引起广东省某规模化猪场保育仔猪发生死亡的病因,本试验采集病猪肝脏、脾脏、心脏、脑、关节液和淋巴结等病料进行细菌分离,并对分离菌株进行纯化培养、菌落形态观察、革兰氏染色、形态学观察、生化试验,用血清型特异性引物进行PCR扩增,并进行毒力基因检测、药敏试验、生长曲线测定及动物试验。结果显示,分离菌株在成牛血清琼脂平板上呈圆形、灰白色、表面光滑、边缘整齐的菌落,镜检为革兰氏阳性球菌,呈链状排列。该菌株的生化试验结果符合链球菌的特征,PCR扩增结果显示猪链球菌保守基因片段（gdh和gapdh）和猪2型链球菌特异的cps2J基因片段均为阳性,表明该分离菌株为猪2型链球菌。毒力基因检测结果表明,该菌株毒力因子基因型为gdh⁺/gapdh⁺/epf⁺/mrp⁺/sly⁺/orf2⁺/fbps⁺。分离菌株用营养肉汤培养6 h达到对数生长期,培养10 h的菌液D_{600 nm}值为0.310。药敏试验结果表明,该菌株对青霉素、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸钾等药物敏感,但对强力霉素耐药。动物试验结果表明,感染分离株的BALB/c小鼠未出现死亡且无明显临床症状,毒力较低。本研究为该猪场链球菌病的防控提供了重要参考信息。