牦牛空肠弯曲菌的分离鉴定及系统发育分析

采集692份临床健康成年牦牛肛门棉拭子标本,无菌划线接种于改良Skirrow培养基上,根据特征的形态学观察、生化试验和PCR检测方法共分离鉴定出空肠弯曲菌15株,阳性率为2.17%;对其中14株菌进行16 S rRNA克隆、测序,经系统发育分析发现牦牛源菌株组内的同源性为99.5%~100%,与Gen-Bank中其他源菌株的同源性为95.8%~100%,系统发育研究表明,牦牛源空肠弯曲菌菌株与国内鸡、猪源和澳大利亚人源L14630菌株的遗传关系较近,与国外其他人源、牛源、鸡源及黑头鸥源菌株有较远的遗传距离。     

规模化养鸭场鸭源大肠杆菌分离株的致病性及系统发育分析

为研究鸭源大肠杆菌(E.coli)的致病性,明确鸭病原性E.coli与人和其他动物E.coli的亲缘关系及O血清型与菌种间遗传关系的相关性,本研究从我国西南地区规模化养鸭场患典型E.coli败血症的雏鸭体内分离37个血清型共82个E.coli分离株(其中优势血清型32株,其他血清型50株),以每株0.2 mL (109 cfu/mL)腿部肌肉接种7日龄健康鸭进行致病性试验;并对其中14个鸭源E.coli代表株进行16S rRNA基因克隆、测序及系统发育分析.结果表明:所有分离株全部为致病性E.coli,其中高致病株、中等致病株和低致病株分别占受试菌株的80.5％(66/82)、17.1％ (14/82)和2.4％(2/82),4个优势血清型全部为高致病株和中等致病株,分别占受试菌株的84.4％(27/32)和15.6％(5/32);14个代表株鸭源E.coli的16S rRNA形成2个主要分支,3株新发现的血清型单独形成一个较远的分支,11株常见血清型与人及其他动物源E.coli形成另一个大的分支,其中有6株与人的O157亲缘关系较近,2株与出血性E.coli O157:H7 sakai聚为一个小分支;从遗传进化的关系分析,这些菌株有可能是人类的潜在病原菌;同时还发现不同血清型的分离株可以聚为一支,而同一血清型的分离株可以处于不同的分支,常规的O血清学分型不能体现菌种间遗传关系的远近.     

鸽源大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

本试验为确定鸽场发病病原,对病死鸽子进行细菌分离,并通过常规鉴定细菌方法以及结合16S rRNA基因核苷酸序列测定等对分离菌进行鉴定。从病死鸽子的肝脏和肺脏中分离出大肠杆菌。分离菌对试验动物小白鼠有很强的致病性。药敏试验结果表明,分离菌对氟苯尼考等较为敏感,对阿米卡星等其他20种药物低敏甚至不敏感。     

犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定及系统进化树分析

为犊牛腹泻病的预防提供理论依据,试验无菌采取犊牛腹泻病牛粪便,进行细菌的纯培养及动物试验筛选致病菌株,利用16S rRNA基因测序,建立病原菌系统进化树,结合致病菌O抗原检测和BD Phoenix~(TM )100全自动微生物鉴定及药敏系统对病原菌进行分析鉴定,最终确定该致病菌的种类并进行治疗与后期防控。结果显示,根据致病茵的O抗原单因子血清检测、 16S rRNA基因测序,构建的系统进化树以及BD Phoenix~(TM )100全自动微生物鉴定及药敏系统鉴定,确定该致病菌株为大肠杆菌O132型并命名为DG;药敏结果显示,该大肠杆菌对阿米卡星、亚胺培南、美洛培能、哌拉西林4种药物敏感,对庆大霉素、头孢唑肟和头孢他啶等13种药物耐药;进化树分析显示该菌与人腹泻的肠膜分离(CP024978.1)、患者粪便分离(CP024992.1)大肠杆菌的亲源性达100%。结果表明,该例犊牛腹泻是由大肠杆菌O132型导致。     

西藏地区牦牛致病性大肠杆菌的分离鉴定

从西藏地区牦牛自然病例中分离出5株大肠杆菌，通过形态观察、生化试验、血清学鉴定及动物致病性试验，表明5株分离菌是培养特性和生化特性基本一致、具有很强致病力、血清型不同的致病性大肠杆菌。     

牦牛瘤胃中产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定

为了解牦牛瘤胃中产纤维素酶的芽孢杆菌种类,无菌采集10份成年麦洼牦牛瘤胃内容物样本,经80 ℃高温水浴20 min后分离得到耐高温芽孢菌.将分离菌株点种至羧甲基纤维素钠培养基上,使用刚果红染液染色筛选产纤维素酶菌株,扩增产酶菌株16S rRNA序列并测序,进行同源性比对和系统进化分析.结果显示:从10份样本中分离到64株菌,从中筛选出产纤维素酶芽孢杆菌共23株,其中蜡样芽孢杆菌16株,苏云金芽孢杆菌7株.系统进化分析结果显示,蜡样芽孢杆菌共分为两大支,有一株菌单独聚为一支,另外15株菌聚为一支,其中这一支又分为五小支,具有一定的遗传多样性;7株苏云金芽孢杆菌分布在一个大支上.该结果为了解牦牛瘤胃产纤维素酶芽孢杆菌的种类和开发牦牛专用微生态制剂奠定了试验基础.     

牦牛肠道与粪便乳酸菌的分离鉴定及PCR-16SrDNA鉴定

以取自四川省不同地区的牦牛粪便、肠道内空物为材料，用MRS琼脂双层培养基进行厌氧培养，分离到50株乳酸菌，经生化鉴定为嗜热链球菌（2株）、乳酸乳球菌（1株）、保加利亚乳杆菌（5株）、嗜粪乳杆菌（10株）、嗜酸乳杆菌（8株）、乳酸乳杆菌（9株）、肠乳杆菌（10株）、弯曲乳杆菌（5株）。采用乳酸菌16 SrDNA通用引物，对分离的8种菌的16S rDNA-段可变区序列进行扩增，均得到大小约470bp的产物；扩增产物经纯化、测序后与GenBank中标准菌株的核甘酸序列比较，同源性均大于97．5％，同源性分析与生化试验的结果是一致的。证实，牦牛肠道和粪便的乳酸菌较为丰富，且乳杆菌的数量较多，这可能与牦牛复杂的生长环境有关。     

动物园野生动物支气管败血波氏杆菌的分离鉴定与系统发育树的构建

采用Biolog和16SrRNA基因序列分析法对分离自北京动物园的8株支气管败血波氏杆菌进行了鉴定。菌株经纯化培养,用Biolog微生物鉴定系统进行了鉴定,结果表明,8株菌株为支气管败血波氏杆菌。菌株经纯化培养,采用菌落PCR方法进行16SrRNA基因序列扩增,扩增产物纯化后直接进行测序。序列经人工校对后用ClustalX1.83软件进行比对分析,最后用Mega3.1软件构建系统发育树,系统发育分析结果表明,8株菌株与支气管败血波氏杆菌DSM10303的同源性达到了99.9%,并在同一个分支内。     

禽大肠杆菌的分离与16S rRNA的鉴定

从疑似患有大肠杆菌病的病死鸡群中采取粪便样品,分离病原进行生化鉴定,从8份样品中分离鉴定出6株大肠杆菌。根据细菌16S rRNA 基因的高度保守性,设计合成大肠杆菌的共同引物,对随机选取的1株细菌进行PCR扩增,并与GenBank中的E.coli 16S rRNA进行序列比对,确定这株细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌提供了一种简单、容易操作的手段。     

山东部分地区毛皮动物肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及系统发育分析

为确诊近两年造成毛皮动物(狐狸、貉子、水貂)死亡的主要细菌性病原,本研究在流行病学调查基础上,对新鲜病死毛皮动物进行临床症状观察、病理学检查,同时取病变肝、肺、气管为样品分离纯化细菌,对所分离的细菌进行形态特征、理化特性检查及药敏试验、致病性试验和16S rRNA基因的分子鉴定.结果显示,从剖检病死毛皮动物的肺、肝、气管组织等均检出同种细菌,分离菌株对菌必治和舒巴坦高度敏感,对小白鼠具有较强致病作用,与已知的肺炎克雷伯氏菌16S rRNA序列的同源性为98.6％～100％.综合分析,该分离菌株为克雷伯氏菌属的肺炎克雷伯氏菌.     

鹅大肠埃希菌的分离鉴定及系统进化树分析

为对发病鹅感染致病性大肠埃希菌的临床治疗提供指导并防控致病性大肠埃希菌感染,本研究无菌采集腹泻鹅及病死鹅脾脏、肝脏等组织器官进行病原菌分离培养、染色观察、生化鉴定、致病性试验,对菌株部分基因进行测序、构建遗传进化树并进行药敏试验。结果显示,普通琼脂培养基上生长出灰白色、圆形、凸起、边缘整齐菌落,麦康凯琼脂培养基上长出玫红色、光滑圆润菌落;分离菌株经革兰氏染色,镜下可见革兰氏阴性菌,两端钝圆、大小中等,多呈单个存在的杆状菌;致病性试验表明,该分离菌株对小鼠、雏鹅均有较高致死率;遗传进化树结果显示,分离菌株与患者粪便分离株（GenBank登录号：CP024992.1）同源性最高,达99.5%;体外抑菌试验发现菌株耐药情况较严重,对大多数抗菌药均有较强抗性,仅头孢噻呋对该分离株有较强的抑菌作用,合理用药后病情得到有效控制。本研究为有效防治鹅大肠埃希菌病提供了理论依据,对规模化鹅场防控大肠埃希菌等其他细菌性疾病具有重要价值。     

仔猪雷极氏普罗菲登斯菌的分离鉴定及系统进化分析

为了解猪雷极氏普罗菲登斯菌（P ．rettgeri）的生物学特性、致病性及16 S rRNA基因系统进化关系,本研究从发生严重腹泻、血便的哺乳仔猪群的内脏器官中分离到1株病原菌,根据形态特征、培养特性、生化特性、16 S rRNA基因序列分析鉴定为 P ．rettgeri。小鼠攻毒试验证实该分离菌株对试验小鼠有较强致病力,哺乳仔猪回归试验可复制出与临床上相似的典型症状,并从发病死亡小鼠及哺乳仔猪中分离到攻毒菌株。系统进化分析表明,分离菌株与雷极氏普罗菲登斯菌系统进化关系最为密切,其16 S rRNA 基因序列与雷极氏普罗菲登斯菌代表菌株的同源性在97．3％～99．6％之间。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢唑啉、头孢呋肟、头孢吡肟、阿莫西林、链霉素、氨曲南、诺氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、氨苄青霉素、阿米卡星、链霉素和阿米卡星等多数药物敏感。本研究首次报道了雷极氏普罗菲登斯菌可以引起哺乳仔猪严重腹泻,提示在仔猪腹泻中应注意该菌感染的诊断、监测和防控。     

禽源大肠埃希菌Biolog鉴定和系统发育分析

采用Biolog和16S rRNA基因序列分析法对中国兽医药品监察所菌种室收集保藏的18株大肠埃希菌(Escherichia coli)进行了鉴定.菌株经纯化培养,用Biolog微生物鉴定系统进行了鉴定,结果表明18株菌株为大肠埃希菌.提取基因组DNA,采用16S rRNA通用引物,用PCR进行16S rRNA基因序列扩增,扩增产物纯化后进行测序.序列经人工校对后用Clustal X 1.83软件进行比对分析,采用Mega 3.1软件构建系统发育树,结果表明18株菌株为大肠埃希菌.     

Isolation and Identification of Cellulase-producing Bacillus in Yak Rumen

To investigate the species of cellulase-producing Bacillus in yak rumen,10 samples of rumen content were aseptically collected from 10 adult Maiwa yaks to isolate the heat-resistant Bacillus by water bath at 80 ℃ for 20 min.The cellulase-producing strains were screened using the CMC-Na medium and Congo red staining.The 16S rRNA gene sequence of those cellulose-producing strains were amplified and sequenced.The results showed that 64 strains were isolated from the 10 samples.Total 23 strains were identified as cellulase-producing bacillus,including 16 strains of Bacillus cereus,7 strains of Bacillus thuringiensis.Furthermore,phylogenetic analysis showed that the 16 Bacillus cereus strains were clustered into two branches:One isolate was clustered into a branch alone,the other 15 isolates were clustered into a branch which clustered into 5 small branches,showing that there was certain genetic diversity in the isolates of Bacillus cereus.And all 7 Bacillus thuringiensis strains were clustered into a branch.Hence,the results layed the foundation of investigating the species of cellulase-producing Bacillus in yak rumen and developing probiotics special for yak.     

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌的分离与16SrDNA的鉴定

从鹅卵黄性腹膜炎临床病例中采集样品,分离病原进行一系列生化鉴定,共分离得到7株致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌,编号为E0238、E0239、E0240、E0453、E0454、E0241、E0245。O血清型鉴定分属于O2、O21、O37、O1、O24、O24、O148。利用16SrDNA扩增试剂盒对随机选取的3株细菌进行PCR扩增,并将PCR产物序列与GenBank中的E.coli16SrDNA进行序列比对,结果显示分离细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。     

仔猪雷极氏普罗菲登斯菌的分离鉴定及系统进化分析

为了解猪雷极氏普罗菲登斯菌(P.rettgeri)的生物学特性、致病性及16SrRNA基因系统进化关系,从发生严重腹泻、血便的哺乳仔猪群的内脏器官中分离到1株病原菌,根据形态特征、培养特性、生化特性、16SrRNA基因序列分析鉴定为P.rettgeri。小鼠攻毒试验证实,该分离菌株对试验小鼠有较强致病力,哺乳仔猪回归试验可复制出与临床上相似的典型症状,并从发病死亡小鼠及哺乳仔猪中分离到攻毒菌株。系统进化分析表明,分离菌株与雷极氏普罗菲登斯菌系统进化关系最为密切,其16SrRNA基因序列与雷极氏普罗菲登斯菌代表菌株的同源性在97.3%~99.6%之间。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢哌酮钠、头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢唑啉、头孢呋肟、头孢吡肟、阿莫西林、链霉素、氨曲南、诺氟沙星、左氟沙星、恩诺沙星、卡那霉素、氨苄青霉素、米诺环素、链霉素、阿米卡星等多数药物敏感。首次报道了雷极氏普罗菲登斯菌可以引起哺乳仔猪严重腹泻,提示在仔猪腹泻中应注意该菌感染的诊断、监测和防控。     

不同省区鸡源大肠杆菌耐药性调查与系统进化群分析

为有效控制鸡大肠杆菌病,对不同省区鸡源大肠杆菌致病菌株的分布情况及耐药特征进行了调查分析,分别采用PCR法和MIC法进行了系统进化群分群检测和药敏试验,采用皮下注射进行了动物致病性试验,并采用SPSS17．0软件进行差异显著性分析。结果显示：低致病群B1（38．13％）和非致病群A（34．02％）菌株分布相对较多,其次是高致病群D（21．23％）和B2（6．16％）;鸡源大肠杆菌耐药严重,12种药物的耐药率在50％以上,多重耐药问题突出,多重耐药率高达98．86％;不同省区鸡源大肠杆菌菌株的耐药程度存在差异,个别药物（如奥格门丁、头孢噻呋等）差异显著;高致病群B2和D群菌株的耐药程度较B1和A群菌株严重,其中氧氟沙星、庆大霉素、大观霉素、头孢噻呋、磺胺异噁唑、复方新诺明、奥格门丁等7种药物差异显著（ P＜0．05）。试验表明,我国鸡源大肠杆菌高致病菌株检出率高,且耐药程度相对严重,在适宜条件下更易导致鸡群发病且较难控制。