环介导等温扩增技术在动物传染病诊断中的应用进展

环介导等温扩增技术是一门新兴的分子生物学检测技术,已广泛用于各种微生物的检测。通过对环介导等温扩增技术的原理、引物设计遵循原则、操作程序简要说明,对近年来环介导等温扩增技术在细菌、RNA病毒、DNA病毒引起的动物传染病中研究和具体应用进展做了重点综述,并对其研究应用前景进行了展望,为该技术广泛应用于动物传染病的诊断提高参考。     

猪圆环病毒2型分子生物学检测方法的研究进展

本文综述了猪圆环病毒2型分子生物学检测方法,主要包括常规PCR、套式PCR、多重PCR、PCR-RFLP、荧光定量PCR和环介导等温扩增等6种方法,对猪圆环病毒2型的监测与相关疾病的诊断有一定的参考价值。     

猪细小病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展

文章论述了猪细小病毒分子生物学诊断方法,包括常规PCR方法、多重PCR方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增技术、基因芯片等,并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述。     

猪流行性腹泻的诊断技术概述

猪流行性腹泻病毒可引起感染猪严重腹泻与脱水,对仔猪有很高的致死率,给全球养猪业带来了重大经济损失,尤其对包括中国在内的亚洲国家的养猪业造成越来越严重的危害。猪流行性腹泻的诊断方法主要有临床症状与病理学诊断以及基于仪器设备的实验室诊断,如病毒分离鉴定、病毒血清中和试验、免疫电镜观察、免疫荧光检测、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应以及环介导等温扩增技术等。然而要确诊该病,必须结合各种检测手段综合判定。     

猪圆环病毒分子生物学诊断技术及基因工程疫苗的研究进展

文章论述了猪圆环病毒分子生物学诊断方法,包括常规PCR方法、套式PCR方法、多重PCR方法、PCRRFLP方法、荧光定量PCR方法、环介导等温扩增技术等,并就其基因工程疫苗方面的研究进行了着重阐述。     

猪圆环病毒3型快速检测方法研究进展

猪圆环病毒3型可引起猪的皮疹、呼吸系统和泌尿系统功能障碍等。快速、准确地检测PCV3对于保障猪的健康和生产具有重要意义。本文综述了当前国内外已报道的PCV3快速检测方法,主要包括免疫学检测方法 (酶联免疫吸附试验、免疫层析技术)、基于PCR的方法 (常规PCR、套式PCR、多重PCR、荧光定量PCR、数字PCR及其他基于PCR的技术)、等温扩增技术(环介导等温扩增、重组酶介导等温核酸扩增、重组酶聚合酶扩增、酶促重组等温扩增以及聚合酶螺旋反应)、原位杂交技术以及宏基因组测序技术。本文还初步探讨了不同方法的原理、特性及优缺点,展望了未来PCV3快速检测方法的发展方向,以期为快速、精准地检测及科学防控PCV3提供参考。     

环介导等温扩增技术在畜牧兽医中的应用研究

随着科学技术的进步,畜牧兽医中对动物的检测技术有了很大的进步,一种名为环介导等温扩增技术的分子生物检测技术,凭借着特异性强、敏感度高、操作方便快捷等特点,正在受到越来越多生物医学研究者所关注。研究表明,将环介导等温扩增技术英语畜牧兽医的检测当中有着非常重要的实际意义。因此,本文主要就环介导等温扩增技术在畜牧兽医中的应用进行了研究,介绍了环介导等温扩增技术的技术原理,分析了环介导等温扩增技术在畜牧兽医的实际应用思路,希望通过此次研究为环介导等温扩增技术未来的深入研究和应用提供参考和借鉴。     

猪圆环病毒3型分子生物学检测方法研究进展

猪圆环病毒3型感染猪后能引起猪厌食、皮炎和肾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤、多系统衰竭综合征等多种疾病,是一种新发的猪传染病,未来可能会给养猪业造成巨大的经济损失。文章综述了6种猪圆环病毒3型分子生物学检测方法,主要包括核酸探针、常规PCR法、套式PCR法、多重PCR法、荧光PCR方法和环介导等温扩增技术,对猪圆环病毒3型的诊断和防控有一定的参考价值。     

非洲猪瘟检测技术进展

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪烈性接触性传染病,能引起所有品种和年龄的猪发病发病过程急,死亡率高。2018年我国首次发生非洲猪瘟疫情。日前,农业农村部公布了ASF现场快速检测试剂名单多种检测试剂盒上市应对ASF的防控。本文将对酶联免疫吸附试验、聚合酶链反应、环介导等温扩增和重组酶聚合扩增试验等对非洲猪瘟诊断技术的最新研究进展进行介绍,为非洲猪瘟综合防控提供借鉴和参考。     

环介导等温扩增技术及其在病原检测中的应用

近年来,环介导等温扩增技术已经被开发利用.它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件(60℃～65℃)下,不到1 h的时间里进行核酸扩增,其扩增效率可达到109～1010个数量级,具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点.环介导等温扩增法已经被用来快速检测动物病原(病毒、细菌、寄生虫).论文就环介导等温扩增法的原理、特点及其在动物病原快速检测中的应用等做了简要的综述.     

环介导恒温扩增技术快速检测非洲猪瘟病毒

以人工合成的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72全长基因为模板,利用在线软件Primer Explorer4设计环介导恒温扩增(LAMP)的内、外引物,通过对反应体系和反应条件进行优化,建立了ASFV的LAMP检测方法,同时进行了敏感性和特异性试验。结果表明,所建立的LAMP检测方法最低检测限可达10拷贝质粒DNA,且具有良好的特异性,LAMP产物的酶切鉴定也验证了反应的特异性。对凝胶电泳后紫外观察、肉眼观察颜色变化、生成沉淀观察以及实时荧光PCR扩增曲线Ct值判定等不同判定方法进行比较表明,以上结果判定方法各有其优缺点,其中荧光PCR的敏感性最高,染色法相对较方便直观,电泳法敏感性稍低。     

环介导恒温扩增(LAMP)-检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu/mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

环介导恒温扩增（LAMP）——检测沙门氏菌

建立一种能够快速准确地检测沙门氏菌的LAMP方法。根据沙门氏菌invA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性试验,通过LAMP与PCR灵敏度的试验与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为63℃,只对沙门氏菌进行扩增;沙门氏菌的检测灵敏度为7～8cfu／mL。LAMP方法检测沙门氏菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测沙门氏菌的新方法。     

Direct detection of equine herpesvirus type 1 DNA in nasal swabs by loop-mediated isothermal amplification (LAMP)

We evaluated loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a means of detecting equine herpesvirus type 1 (EHV-1) DNA directly from nasal swabs. To increase the sensitivity, we added a step in which the samples were heat-treated to the original LAMP procedure. The detection limit of the LAMP assay with heat treatment was 10 times more sensitive than the original LAMP assay even when the DNA extraction step was omitted. In addition, the LAMP assay with heat treatment was more sensitive than the original LAMP assay and the polymerase chain reaction using clinical samples. The LAMP assay with heat treatment is easy to perform and so should be applicable to the diagnosis of EHV-1 infections in clinical laboratories.     

动物饲料中沙门氏菌环介导等温扩增(LAMP)快速诊断方法的建立

根据GenBank公布的沙门氏菌高度保守的fimY蛋白基因序列,利用Primer explorer V4软件设计4条针对沙门氏菌fimY基因的特异性引物,通过对Mg²⁺浓度、dNTP浓度、反应温度、反应时间、特异性、敏感性、重复性和稳定系及符合率等方面,优化LAMP各种反应条件,建立针对沙门氏菌LAMP快速诊断方法。结果表明,该方法具有较强的特异性;比PCR检测方法敏感性高100倍,对沙门氏菌的最低检出量为6.2 CFU/mL;对24份样品的3次检测结果与国标法完全一致。证明建立的针对fimY蛋白基因的LAMP检测方法操作简便,特异性强,敏感性高,适用于现场检测。     

3种新城疫病毒核酸扩增检测方法的比较研究

本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg^2＋浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58 pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158 pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。     

牛附红细胞体LAMP检测方法的建立

为建立一种快捷、灵敏的牛附红细胞体检测方法,本研究根据GenBank上发表的16S rRNA基因(登录号:AF016546)序列设计合成2对LAMP特异引物,建立了检测牛附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)方法,并优化了LAMP的各反应条件,进行了敏感性和特异性试验。LAMP扩增产物经电泳、显色鉴定。结果显示,LAMP方法扩增牛附红细胞体产物呈特征性梯状条带,显色反应呈现绿色荧光;敏感性检测最低浓度为25.6 fg/μL;特异性试验结果显示,牛附红细胞体检测管显色后呈阳性,而猪附红细胞体、牛新孢子虫、弓形虫及牛瑟氏泰勒虫等对照组均呈阴性,说明本研究建立的LAMP方法具有灵敏、特异、快速等优点,适合于牛附红细胞体的检测。     

Establishment and Application of LAMP Detection Method of Bovine Viral Diarrhea Virus

Since the 5'UTR gene (GenBank No.:AY278459.1) had 4 isolated regions,we designed a set of 4 LAMP primers to specifically recognize target gene sequences.This study developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for detecting BVDV,using the pyrophosphate magnesium white precipitate for Real-time detection in LAMP reaction process of turbidity instrument,Real-time monitor liquid turbidity to determine result.The whole reaction lasted only 50 minutes at a constructed temperature of 63 ℃ to evaluate specificity,sensibility and repeatability of the method.The result demonstrated that the LAMP assay could only react with BVDV,its specificity was high;It could detect at least 10^-6-fold diluted samples,which was 100 more sensitive than PCR assay;And repeatability was good.The simple,rapid,high siensitivity and specificity LAMP assay was a potential tool for the detection of BVDV in field conditions.     

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) test for specific and rapid detection of Brucella abortus in cattle

Background: Brucella abortus, the major causative agent of abortion in cattle and a zoonotic pathogen, needs to be diagnosed at an early stage. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) test is easy to perform and also promising to be adapted at field level.

Objective: To develop a LAMP assay for specific and rapid detection of B. abortus from clinical samples of cattle.

Methods: LAMP primers were designed targeting BruAb2_0168 region using specific software tool and LAMP was optimized. The developed LAMP was tested for its specificity with 3 Brucella spp. and 11 other non-Brucella spp. Sensitivity of the developed LAMP was also carried out with known quantity of DNA. Cattle whole blood samples and aborted fetal stomach contents were collected and used for testing with developed LAMP assay and results were compared with polymerase chain reaction (PCR).

Results: The developed LAMP assay works at 61 °C for 60 min and the detection limit was observed to be 100-fold more than the conventional PCR that is commonly used for diagnosis of B. abortus. Clinical sensitivity and specificity of the developed LAMP assay was 100% when compared with Rose Bengal plate test and standard tube agglutination test. SYB® green dye I was used to visualize the result with naked eye.

Conclusion: The novelty of the developed LAMP assay for specifically detecting B. abortus infection in cattle along with its inherent rapidness and high sensitivity can be employed for detecting this economically important pathogen of cattle at field level as well be exploited for screening of human infections.