牛支原体膜蛋白6种提取方法的比较研究

为筛选最佳牛支原体(mycoplasma bovis,Mb)膜蛋白的提取工艺,本试验以牛支原体W70株为代表,分别比较了4种浓度的TritonX-100 、TritonX-114、TritonX-100和TritonX-114;3种浓度碘化钾(KI)复合提取;反复冻融和超声裂解等6种Mb膜蛋白提取工艺和参数.各方法所获膜蛋白经SDS-PAGE和Bradford定量分析表明:不同方法的提取物中蛋白多肽和蛋白浓度各异;其中以3％ TritonX-114和0.4％TritonX-100结合0.6 MKI两法提取的蛋白条带清晰度较好,蛋白浓度及蛋白收集率较高,蛋白多肽条数24～28条,蛋白相对分子质量分别在170 000～12 200和167 000～11 400之间;超声裂解及反复冻融法提取效果一般;而1.8 MKI法效果最差.研究发现3％TritonX-114或0.4 ％TritonX-100结合0.6 MKI是Mb膜蛋白较优的提取方法.     

牛支原体GAPDH定点突变、原核表达及生物学特性初步分析

根据已发表的牛支原体GAPDH基因序列设计引物,从牛支原体湖北分离株扩增出GAPDH基因,亚克隆于载体pET-30a。设计定点突变引物,采用环状PCR法对载体上GAPDH基因进行两轮定点突变,原核表达突变成功的重组质粒,获得重组牛支原体GAPDH蛋白,经Western-blot证实该重组蛋白具有较好的反应原性,为其在牛支原体病防控中的应用奠定了基础。     

婆罗门牛的部分生物学特性

婆罗门牛（Ｂｒａｈｍａｎ）作为一个肉用瘤牛品种,也许是目前世界上应用最为广泛的一个瘤牛品种,它不但作为纯种牛在热带亚热带的肉牛生产中起着重要作用,而且作为育种材料广泛用于肉牛新品种的育成,如美国用婆罗门与不同的品种育成了圣格鲁迪斯牛、婆罗格斯、婆罗福...     

牛支原体脂质相关膜蛋白P48、DnaK和L-LDH免疫反应原性的鉴定及分析

为筛选并鉴定免疫反应原性良好的牛支原体(M.bovis)蛋白,本研究提取M.bovis TJ株脂质相关膜蛋白(LAMPs),通过AKTA分子筛筛选,将M.bovis LAMPs分为5组,经dot blot试验鉴定各组LAMPs的免疫反应原性,并经蛋白质谱分析其蛋白组分.结果显示,5组LAMPs中有1组膜蛋白反应原性较好...     

猪肺炎支原体及其生物学研究进展

猪肺炎支原体是引起猪支气管肺炎的主要病原 ,严重危害着养猪事业的发展。虽然猪肺炎支原体的结构简单 ,但由于它对营养要求较高 ,故培养难度大 ,也是人们不能对其深入研究的一个主要原因。近年来利用克隆技术 ,对猪肺炎支原体从基因水平上进行了多种研究 ,已经取得了一些可喜成果。文章从它的生物学特性、荚膜结构、膜蛋白研究以及基因水平的研究等方面进行了综合性论述 ,并简明地指出了目前研究中存在的问题以及未来展望     

牛支原体耐药性研究进展

在对国内外牛支原体的耐药性研究进展做以综述的基础上,对近年来支原体的耐药机制进行了概述,以期为养牛业生产中牛支原体病的防治和耐药机制的研究提供参考.     

牛支原体表面一种新的膜蛋白(P33)的特性研究

牛支原体(M.bvis)是牛支原体肺炎的病原体,能够引起犊牛肺炎等多种疾病.研究表明,牛支原体粘附蛋白可能在牛支原体致病过程中起关键作用.本研究选取了牛支原体的一个假定膜蛋白,对其基因进行PCR扩增,并连接到pET-28a载体,转化于大肠杆菌BL21 (DE3)中,通过IPTG诱导获得了以可溶形式表达的重组蛋白,该重组蛋白大小约为36 ku,将其命名为P33.纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.重组蛋白与胎牛肺细胞(EBL)作用,通过激光共聚焦显微镜观察到了明显的粘附作用,而ELISA试验证明该蛋白的这种粘附为特异性粘附,从而证明该蛋白是牛支原体的一个粘附相关蛋白.     

牛输卵管上皮细胞培养、纯化及其生物学特性的研究

对牛输卵管上皮细胞进行了原代及传代体外纯化培养,并对输卵管上皮细胞的生物学特性通过普通光镜、扫描电镜、免疫组化、流式细胞技术进行观察、鉴定和检测等相关研究,建立了一种稳定的制备纯度较高的牛输卵管上皮细胞体外培养方法,为进一步研究胚胎共培养和核移植供体细胞奠定了基础。     

牛支原体病流行病学及其诊断技术研究进展

牛支原体是一种能引起牛发生肺炎、乳房炎和关节炎等疾病的高度传染性病原体,在全球范围内分布和流行,具有高变异性,能在不同的地理环境独立进化,在地理起源方面表现出高度的多样性.牛支原体在遗传变异、致病力、传播扩散等方面都存在极大的不确定性.本文就牛支原体病的病原学、流行病学、传播途径和诊断方法等方面的研究进展进行综述,以期...     

牛支原体免疫学及免疫学诊断研究进展

<正>牛支原体是一种能够感染任何年龄牛的致病微生物,导致患牛严重的呼吸系统疾病、生殖系统疾病、角膜炎、乳腺炎及关节炎等。1961年,首次从美国乳腺炎患牛中分离到了牛支原体[1],全球范围内均报道了由牛支原体感染导致奶牛乳房炎所造成的经济损失案例。在我国,于2008年首次在重症肺炎的患牛中发现了牛支原体[2],并在2011年完成了测序[3],比较基因组学分析表明牛支原体不同分离株之间毒力存在着明显差异[4-7]。现阶段尚无有效的牛支原体疫苗可作     

牛支原体不同分离株全菌蛋白免疫印迹分析

为比较牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）不同分离株间全菌蛋白组成的差异,找到其具有免疫原性的蛋白片段,试验采用裂解液法提取分离自全国不同地区6株M.bovis分离株（W70株、1738株、Q3株、Q1株、JX02株、677株）的全菌蛋白,并利用自制抗血清对所获蛋白进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。结果显示,6株分离株全菌蛋白条带数量、清晰度存在差异,其中W70株、1738株、Q3株和Q1株的蛋白条带数量及清晰度均优于JX02株和677株,蛋白质分子质量范围在23.2～130.8 ku之间;6株分离株均显现2条大小为55和43 ku的免疫杂交条带。综上所述,M.bovis不同分离株全菌蛋白组成存在差异,55和43 ku是其主要的免疫原性蛋白之一,该试验结果为M.bovis病血清学诊断、分子诊断技术及疫苗的研制提供理论依据。     

牛支原体药物敏感性试验

为了解牛支原体的体外药敏试验,以指导临床合理使用抗生素,对临床分离鉴定的3株牛支原体,采用微量稀释法测定其对环丙沙星、恩诺沙星、红霉素和诺氟沙星的最低抑菌浓度(MIC),重复3次,取平均值。结果表明,牛支原体对环丙沙星的MIC抑菌范围为64μg/mL～128μg/mL,对恩诺沙星的MIC值为4μg/mL～8μg/mL,对红霉素的MIC值为2μg/mL～4μg/mL,对诺氟沙星的MIC值在8μg/mL～16μg/mL之间。牛支原体对红霉素的耐药性最低,其次是恩诺沙星、诺氟沙星,对环丙沙星的耐药性最高。     

牛支原体引起奶牛乳房炎的诊断

牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起成年牛乳房炎和犊牛肺炎、关节炎的主要病原之一。本文从有乳房炎临床症状的奶牛中采集牛奶样本,经细菌培养和支原体培养、特异性PCR与环介导等温扩增（LAMP扩增）和16S rRNA测序等病原学检测证实为牛支原体感染,同时还有其他细菌的混合感染。     

重庆市某肉牛场牛支原体肺炎的诊断

重庆市某肉牛场新进育肥牛群发生以呼吸系统感染为主的传染性疾病,为确诊病因,对表现明显临床症状的病牛进行迫杀,无菌采集肺脏、肝脏、血液和心肌进行病原分离,共分离到4株菌,分别编号为CQ1、CQ2、CQ3、CQ4.经16S rRNA序列比对,CQ1与牛支原体同源性达99.9％,CQ2与羊创伤球菌同源性达99.8％,CQ3、CQ4分别与大肠杆菌和沙门氏菌同源性达99％.通过培养特性、菌落形态观察、牛支原体特异性引物PCR扩增,确定CQ1为牛支原体;药物敏感性试验和动物试验表明,该分离株对环丙沙星、氧氟沙星、四环素、壮观霉素敏感,不致死小白鼠.按牛支原体肺炎临床用药后,疫情很快得到控制,结合实验室检测结果,确认该场爆发的是以牛支原体感染为主的牛支原体肺炎.     

牛支原体的分离鉴定及其对体外药物的敏感性分析

为探讨兽医临床治疗牛支原体肺炎常用药物的有效性,采用形态观察、分子生物学等方法对病原菌进行鉴定,共获得4株牛支原体,继而对分离菌株进行耐药性检测。结果表明,4株牛支原体均对大环内酯类抗生素耐药,对氟喹诺酮类及四环素类抗生素相对敏感。实验结果为兽医临床对牛支原体肺炎的治疗具有一定的指导意义。     

牛支原体新疆株的分离鉴定

为调查新疆规模化奶牛场病牛死亡原因并确定病原,本研究无菌采集7份肺炎病死牛病变肺组织样,通过牛支原体液体培养基和固体培养基分离到1株支原体,采用形态学观察和生化试验鉴定该分离株,采用支原体特异性引物和牛支原体16S rRNA通用引物扩增基因序列并测序,使用DNAStar软件将分离菌株测序结果与GenBank中的标准株序列进行同源性比对,采用Mega 6.0软件中的邻接法(Neighbor-Joining,NJ)依据16S rRNA序列构建分离株系统进化树。结果显示,分离株菌落呈典型的"煎蛋样",菌落中心凹陷深入培养基,周边菲薄而透明,经Dienes染液染色后,菌落中心呈深蓝色。该分离株不分解葡萄糖、尿素、不水解精氨酸,血细胞吸附试验和溶血试验均呈阴性,氯化三苯基四氮唑还原反应呈阳性,产生膜和斑。PCR反应扩增出大小为1 911 bp的牛支原体特异性目的片段;分离株16S rRNA基因序列与牛支原体标准株PG45的序列同源性为99.8%,与牛支原体地方株(Mb NM2012、Mb HB0801、Mb Hubei-1、Mb Ningxia-1、Mb CQ-W70和Mb 08M)的同源性为99.3%～99.7%。系统进化树显示,分离株16S rRNA基因与Mb Ningxia-1株和Mb 08M株亲缘关系较近,处于同一分支。本研究结果证实了引起病牛死亡的病原为牛支原体,为新疆牛支原体病的防治提供了科学依据。     

2013年-2015年宁夏地区牛支原体感染的血清学调查分析

为了摸清宁夏地区肉牛和奶牛牛支原体(Mycoplasma bovis)感染情况及流行趋势,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对2013年-2015年采集自宁夏地区肉牛主要养殖区的57个肉牛场886份血清和奶牛主要养殖区的39个奶牛场1 088份血清进行检测.结果发现,2013年抽检的16个奶牛场阳性率为32.17％(148/460),场群阳性率100％(16/16);2014年抽检的银川地区12个奶牛场,阳性率为26.52％(61/230),场群阳性率100％(12/12);2015年抽检的11个奶牛场,阳性率为44.97％(179/398),场群阳性率100％(11/11);2014年阳性率较2013年和2015年低,2015年最高,2013年与2014年阳性率差异不显著(P>0.05),2015年与2013年和2014年的阳性率差异极显著(P<0.01).2013年抽检的19个肉牛场,阳性率为7.26％(18/248),场群阳性率为26.32％(5/19);2014年抽检的38个肉牛场,阳性率为5.02％(32/638),场群阳性率为50％(19/38);2014年较2013年的阳性率低,但差异不显著(P>0.05),而且部分地区和肉牛场未检测到牛支原体阳性血清.上述结果表明,宁夏地区奶牛养殖场牛支原体感染状况较为严重,应引起养殖场的高度重视.     

牛支原体疫苗的研究进展

牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）是一种造成全世界范围内育肥牛和奶牛多种疾病综合征的重要病原体。临床症状主要包括长期性肺炎及多发性关节炎（CPPS）、呼吸道疾病综合征（BRD）、乳腺炎及生殖器官疾病。牛支原体能感染多种组织和器官,也能从健康的牛体内分离,是威胁畜牧业生产的主要病原体。由于临床上抗生素治疗效果不佳,预防或控制牛支原体感染最好的选择是研发有效的商业可用的疫苗。牛支原体疫苗的研究已历经多年,虽然存在很多问题,但也取得了一定进展。文章对牛支原体弱毒疫苗、灭活疫苗及亚单位疫苗的研究进展进行了总结,并讨论了疫苗设计的优化方案,为合理设计和研发有效的牛支原体防控技术提供参考。     

一株牛支原体的分离鉴定及致病性初步研究

对采集到的疑似牛支原体肺炎肺组织病料进行病原的分离,并对分离株进行形态学、生化和分子生物学鉴定,结果显示成功分离获得1株牛支原体,命名为NM001.该分离株的菌落形态呈典型的"荷包蛋状",不能发酵葡萄糖,不能水解精氨酸,不分解尿素.PCR能够扩增出牛支原体特异的P48基因条带,16S rRNA基因序列与Ningxia-...     

3种ELISA试剂盒检测抗牛支原体抗体的比较

为比较3种抗牛支原体(M.bovis)血清抗体的ELISA试剂盒检测效果,本实验应用3种检测M.bovis血清抗体ELISA诊断试剂盒对38份阳性样品(自然感染19份,人工感染18份)和37份阴性样品进行检测.结果表明:本实验室制备的HVRI试剂盒与商品化试剂盒Kit 1的检测结果和综合检测结果符合率分别达到92%和96%;而商品化试剂盒Kit 2的检测结果与综合检测结果符合率仅为74.67%.一致性检验结果显示:HVRI试剂盒与Kit 1的一致性较高;Kit 2与HVRI试剂盒、Kit 2与Kit 1有中度的一致性.此外,3种试剂盒对牛传染性胸膜肺炎国际标准血清(PS2)的检测结果显示HVRI试剂盒和Kit 1均为为阴性,Kit 2为阳性.因此,HVRI试剂盒与Kit 1更适于M.bovis检测和开展流行病学调查.