牡丹ISSR-PCR反应体系正交优化设计

以“凤丹(”Paeonia ostii)基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,研究牡丹ISSR反应体系的影响因素,建立了适合牡丹的ISSR反应体系及程序。10 lμ反应体系为:1×反应缓冲液,2.5 mmo1/LMg2+,0.4 mmo1/LdNTPs,1.0 UTaq聚合酶,0.75μmol/L引物,10～20 ng模板DNA。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性45 s,45～60(℃不同引物退火温度各异)复性45 s,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min;4℃保存。通过梯度退火试验,确定不同引物的退火温度。     

利用正交设计优化向日葵ISSR-PCR反应体系

向日葵产业的发展对调整黑龙江省种植业结构、利用中低产田、增加农民收入具有十分重要的作用,为了推广ISSR分子标记技术在向日葵分子育种上的应用,利用正交设计对向日葵ISSR-PCR反应体系中的5个因素(模板DNA、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度、Taq酶用量)在4个水平上进行优化,确立了适合向日葵ISSR-PCR反应的20μL体系:50ng模板DNA、2.0μmol·L-1dNTP、37.5μmol·L-1 Mg2+、8μmol·L-1引物、8UDNA Taq酶。     

黔产苦参ISSR-PCR反应体系正交优化研究

[目的]确定适合苦参稳定的ISSR-PCR反应体系。[方法]采用经典的CTAB法提取苦参新鲜幼嫩叶片DNA;针对Mg2+、d NTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶进行正交设计L_(16)(4~5),优化黔产苦参ISSR-PCR反应体系。[结果]最适ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 90 ng、0.4μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg~(2+)、TaqDNA聚合酶0.5 U、0.5 mmol/L d NTPs。[结论]建立的苦参ISSR-PCR反应体系,经过19份苦参样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于苦参遗传多样性分析。     

正交设计优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系

[目的]优化大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系,为大旗瓣凤仙遗传多样性分析提供技术参考.[方法]利用正交试验设计对大旗瓣凤仙ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA)4水平进行优化分析,并在此基础上对PCR反应过程中的退火温度进行筛选.[结果]建立了大旗瓣凤仙ISSR-PCR的优化反应体系,即在25.0 μL反应体系中含1×PCR Buffer、Mg+ 1.5 mmol/L、dNTP 0.25 mmol/L、引物0.8 μmol/L、TaqDNA聚合酶0.75~1.00 U、模板DNA 100 ng.通过该体系可以筛选出6条对大旗瓣凤仙种群扩增效果较好的引物.[结论]优化的ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性,可用于大旗瓣凤仙及凤仙属植物种群的ISSR遗传多样性分析.     

桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化

采用正交试验设计L₁₆(4⁵)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg²⁺、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg²⁺>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含25 ng/μL DNA模板1μL、10×PCR buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5 mmol/L Mg²⁺ 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1μL、5 U/μL rTaq 0.1μL。优化得到的反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,合适的退火温度退火45 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,16℃保存。通过梯度PCR,确定引物ID37的退火温度为49.5℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

采用正交设计方法优化梨ISSR-PCR反应体系

采用正交设计的方法对梨ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用DPS数据处理软件分析,建立的梨ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq DNA聚合酶1.0U、M2+的浓度2.0mmol·L-1、模板DNA 10～80 ng、dNTPs 0.10mmol·L-1、引物0.3 μmol·L-1.对梨ISSR-PCR最佳反应体系进行了梯度退火试验,得到的最佳退火温度为55℃.     

长春花ISSR-PCR 反应体系的正交优化

[目的]筛选最适的长春花ISSR-PCR反应体系。[方法]采用正交试验方法,对影响长春花ISSR-PCR反应体系的引物浓度、dNTP浓度、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶浓度和模板DNA浓度5个因素在4个水平上进行正交试验,建立适合长春花ISSR-PCR的反应体系。[结果]长春花ISSR-PCR反应体系的最佳条件：引物浓度0.50μmol/L,dNTP浓度0.10 mmol/L,Mg2＋浓度3.00 mmol/L,Taq酶浓度0.75U/25μl,DNA模板浓度350 ng/25μl。采用该反应体系筛选出12对适合于长春花ISSR-PCR反应的引物。[结论]利用优化系统进行长春花的ISSR-PCR反应,可获得稳定性高、重复性好、背景清晰的电泳结果。     

药用植物白术ISSR-PCR反应体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,对白术ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适合于白术的ISSR-PCR反应的最佳体系,即在25 μL反应体系中,10×buffer 2.5 μL,Mg2+3 mmol/L,Taq酶0.75U,模板200 ng,dNTP 0.3 mmol/L,引物0.5 μmol/L,通过梯度PCR试验得到相应引物的最佳退火温度为55.0℃.     

甜槠ISSR-PCR 反应体系的正交优化

对甜槠Castanopsis eyrei 进行遗传多样性研究的过程中, 为了获得清晰可靠、重复性强的ISSR 扩增结果, 利用正交设计对Mg 2+ , dNTP , 引物, Taq 酶, 牛血清蛋白(BSA )和模板DNA 等6 种因素5 个水平进行筛选和优化。确定甜槠ISSR-PCR 最适宜反应体系为:10 L 反应体中, 1 Taq 酶配套缓冲液(10 mmolL-1 Tris-HCl , pH 9.0 , 50 mmolL-1 KCl , 10 gL-1 TritonX-100), 1.7 mmolL-1 Mg 2+ , 0.25 mmolL-1 dNTP , 8.34 nkat Taq DNA 聚合酶, 1.5 gL-1牛血清白蛋白, 6 pmol 引物, 12 ng 模板DNA 。甜槠扩增时引物UBC846 的最适退火温度为56.3 ℃。图2 表1 参23     

正交设计优化棉花黄萎病菌ISSR-PCR反应体系

采用正交试验设计方法,对ISSR的影响因素进行研究,从Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平进行优化试验,筛选并建立了适合棉花黄萎病菌的ISSR-PCR最佳反应体系,即25 μL的反应体系中含有1×PCR buff-er,00 μmol/L dNTP,.75 μmol/L引物,50 mmol/L Mg2+,U TaqDNA聚合酶和40 ng模板DNA.     

五节芒ISSR-PCR反应体系的优化

［目的］保护五节芒的种质资源并为其开发利用奠定基础。[方法]以五节芒DNA为材料,分析DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。并通过单因子试验对ISSR-PCR反应体系进行优化。［结果］建立了五节芒ISSR-PCR的最佳体系：25 μl反应体系中10×PCR Buffer 2.5 μl、0.2 mmol/L 4×dNTP、1.5 mmol/L Mg^2＋、0.75 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30s;51-53 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,40个循环;72 ℃再延伸7 min。利用优化反应体系从100个ISSR通用引物中筛选出了11个稳定性高、重复性好的引物。［结论］这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究五节芒遗传多样性奠定了基础。     

黄皮ISSR－PCR反应体系的优化

为应用ISSR分子标记对黄皮种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究,通过单因素和正交试验对ISSR-PCR反应体系进行优化.结果表明,采用改良SDS法提取的DNA条带完整、无RNA污染,适于ISSR-PCR扩增;黄皮ISSR分析最适的扩增体系是:20 μl的反应体系中含30ng的模板DNA、1.5 U TaqDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、0.3 mmol/L dNTPs以及引物(gA)8C的最佳退火温度为520.4℃.     

铜鱼ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

采用正交设计方法,对影响铜鱼(Coreius heterodon(Bleeker))ISSR-PCR扩增结果的5个因素,如Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA的浓度,在4个水平上进行了比较优化,建立了适合铜鱼的最佳ISSR-PCR反应体系:在25μL反应体系中含有1.5 mmol/L Mg~(2+),0.16 mmol/L dNTP,0.2 μmol/L引物,lU Taq DNA聚合酶和140 ng模板DNA.检验结果表明,采用该反应体系对铜鱼进行ISSR-PCR扩增可获得多态性高,稳定性和重复性好的电泳条带.

Abstract：

The method of orthogonal design was used to optimize five factors,i.e.concentration of Mg~(2+),dNTP,primer,Taq DNA polymerase and DNA temple,which affect ISSR-PCR amplification results of Coreius heterodon(Bleeker),each at four levels,and an optimal ISSR-PCR reaction system for C.heter-odon(Bleeker)was established:an ISSR-PCR reaction system with a total volume of 25 μL containing 1.5mmol/L Mg~(2+),0.16 mmol/L dNTP,0.2μmol/L primer,1U Taq DNA polymerase and 140 ng DNA tem-pie.The testing results of the reaction system confirmed that it can produce stable and reproducible electrophoretic bands with high polymorphism of ISSR-PCR for C.heterodon(Bleeker).