用一中和性单克隆抗体使小鼠及绵羊能被动地保护抵抗蓝舌病病毒的攻击

己培养建立的小鼠淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体6C_2 A.4.2株,经用RIA标化,证明它属于免疫球旦白G类。在RIA中,可与17型BTV结合,但不能和19型BTV结合,可以中和17型BTV,抑制17型BTV的血凝作用,可以沉淀来自17型BTV感染细胞的病毒多肽2及3,(VP_2、VP_3)。接种杂交瘤细胞于小鼠腹腔内,可产生腹水。这种腹水仅含有非中和性的同型血抗17型BTV的抗体,可对导致初生乳鼠死亡的17型BTV提供血清型特异性的被动保护作用。将含有6C_2A.4.2株抗体的小鼠腹水,静脉     

蓝舌病病毒分离株的定型研究

用国际标准蓝舌病病毒(BTV)型特异性血清和新制备的BTV型特异性血清,按OIE推荐方法进行蚀斑抑制试验,并试用“悬浮法”蚀斑抑制试验,对BTV分离株(L001)作了血清型鉴定,结果表明该分离株为BTV16型。与标准毒株相对照,两者试验结果完全一致;L001株的RNA的PAGE电泳带谱与BTV16型标准株的带谱相同。     

IBD病毒古典株和变异株之间抗原相关性的研究

传染性法氏囊病毒(IBDV)属于双股RNA病毒科,其基因组由两个片断的双链RNA组成.目前公认IBDV含有4种蛋白质:VP_1(90KDa)、VP_2(40KDa)、VP_3(32KDa)和VP_4(28KDa).另外还有一种附加蛋白质VP_x(48KDa),被认为是VP_2的前体.VP_2是重要的宿主保护性抗原,带有诱发中和抗体的抗原决定基.该中和抗体可区别两种血清型以及血清Ⅰ型中各毒株.VP_3是群特异性抗原.美国和欧洲已发现两种抗原性不同的血清型.大量的交叉中和试验表明,血清Ⅰ型各毒株间存在明显的抗原性差异.Jackwood等在参试的13个血清Ⅰ型毒株中鉴别出6个亚型.近来单抗的应用使人们已能分析IBDV血清Ⅰ型古典株和变异株之间的抗原性差异.Snyder等报道,从美国分离的新毒株发生了抗原漂移,从而导致了血清Ⅰ型古典株病毒两个中和位点中的一个发生缺失或移位.     

蓝舌病毒8型VP7蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

对蓝舌病毒(BTV)8型群特异性抗原VP7蛋白进行了原核表达,制备了单克隆抗体(McA b),并分析其特性。将BTV 8型VP7蛋白基因分别克隆至p ET-28a-c(+)和p MAL-c5x载体中,在大肠杆菌中诱导表达分别带组氨酸标签(His)和麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的的融合蛋白His-VP7和MBP-VP7。用纯化的His-VP7免疫BALB/c小鼠制备McA b,以MBP-VP7为包被抗原筛选分泌McA b的杂交瘤细胞。筛选出的1株抗BTV的McA b命名为3F4,亚类鉴定为IgG 1型;该单抗既能与重组BTV VP7蛋白发生反应,又能识别BTV,为BTV的血清学检测提供了工具。     

蓝舌病病毒17型VP2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备蓝舌病病毒(BTV)血清17型VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究用原核表达系统部分重叠表达的两段VP2蛋白共同免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得杂交瘤细胞,通过以重组VP2蛋为白包被抗原的间接ELISA筛选获得2株稳定分泌抗BTV17 VP2蛋白的MAbs杂交瘤细胞株,分别命名为3F4和4H10.Ig亚类鉴定2株MAbs均为IgG1/k链.Western blot证明,2株MAbs均能识别重组VP2蛋白.间接免疫荧光试验表明:2株MAbs均与BTV17呈阳性反应,其中MAb 3F4与BTV1、BTV2、BTV3、BTV5、BTV8、BTV11、BTV13、BTV16、BTV23、茨城病病毒(IBAV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼肠孤病毒(RV)均呈阴性反应,但与BTV10和BTV24呈弱阳性反应.利用合成多肽对VP2抗原表位鉴定结果表明,MAb 3F4识别的抗原表位为540DPWNNR545,MAb 4H10识别的抗原表位为540DPWNNRA546.本研究结果为建立BTV17型特异性检测方法及VP2功能研究奠定了基础.     

O型口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和鉴定

利用O型口蹄疫病毒(FMDV)免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选和7次亚克隆后获得2株能稳定分泌单克隆抗体(MeAb)的杂交瘤细胞株.经间接ELISA检测,2株杂交瘤细胞株(3E1、7E6)的腹水效价分别为1:25 600、1:102 400.间接免疫荧光试验和特异性试验表明2株McAb可与不同株的O型FMDV反应,而不与其他血清型的FMDV反应.Western blot和叠加试验表明2株单抗可识别0型FMDV结构蛋白VP1上的同一个抗原表位.此特异性McAb的获得将为O型FMDV疫苗的研制和诊断方法的建立奠定基础.     

抗蓝舌病病毒VP6和VP7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备针对蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb),本研究利用血清型1型BTV(BTV1)免疫BALB/c鼠,将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,并用BTV1包被ELISA板,通过间接ELISA方法筛选出3株稳定分泌抗BTV1的MAb的杂交瘤细胞株(2B10、3D4和4H8)。利用表达BTV1主要蛋白的真核表达重组质粒转染BHK-21后,对所制备的杂交瘤细胞株上清进行间接免疫荧光(IFA)以及western blot鉴定,结果显示:2B10和4H8与VP7蛋白反应,而3D4与VP6蛋白反应。同时,IFA鉴定结果进一步表明,3株MAb与24个血清型的BTV均可以发生反应。本研究制备的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

抗蓝舌病毒VP7单克隆抗体的制备及其特性

为了提高蓝舌病毒（BTV）快速免疫诊断方法的灵敏度和特异性，对蓝舌病毒VP7的特异性单克隆抗体的制备进行了研究。用纯化BTV1颗粒为免疫原，以重组BTV13 VP7为筛选抗原建立了能分泌高效价单抗的6个杂交瘤细胞株，抗体滴度最高可达1：320000000。初步结果表明，所获单抗和VP7的结合可被不同型BTV参考血清阻断。随后用单抗与重组VP7抗原初步建立竞争抑制ELISA方法，对21份血清进行测定，结果与间接ELISA检测结果完全符合，有可能用于建立我国BTV快速可靠的新型诊断方法（竞争ELISA）。     

蓝舌病病毒3型VP5蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位鉴定

为制备血清3型蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白的单克隆抗体(MAb)及鉴定其抗原表位,本研究利用pMAL-C4x原核表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,并以Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达、纯化的重组VP5蛋白为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗BTV3 VP5蛋白的MAb杂交瘤细胞株(3F2)。间接免疫荧光结果表明:MAb 3F2与BTV3、BTV5、BTV9、BTV16呈阳性反应;与BTV6、BTV7、BTV13、BTV21呈弱阳性反应;与其它BTV血清型均呈阴性反应。利用原核表达的麦芽糖结合蛋白(MBP)融合短肽对MAb 3F2识别的抗原表位进行鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为89PGERGIQMKIKEIEEE104。氨基酸序列比对结果显示该表位在不同地域来源的BTV3株间比较保守。该MAb的制备和鉴定为进一步研究VP5蛋白的结构和功能奠定了基础。     

4型蓝舌病病毒VP2单克隆抗体抗原表位的鉴定

为鉴定蓝舌病病毒(BTV)的单克隆抗体(MAb)所识别的VP2蛋白竞争抑制型特异性抗原表位,本研究采用噬菌体展示技术对BTV VP2蛋白抗原表位氨基酸进行筛选。经过3轮淘选后进行测序,测序结果经分析比对后获得共同的短肽序列为~(160)NH~(161)。~(160)NH~(161)与已有的单抗杂交瘤细胞4A-1G7上清、腹水均发生特异性反应,并且~(160)NH~(161)与4型BTV阳性标准血清反应良好。本研究结果为4型BTV检测方法的建立及VP2蛋白结构和功能的研究奠定了基础。     

蓝舌病毒群特异性RT—PCR检测技术及其应用

目的:建立一种适于蓝舌病毒(BTV)群特异性基因检测的RT-PCR方法。方法:根据本实验室设计的一对BTVNS1基因通用型检测引物建立BTV群特异性RT-PCR检测技术;对不同血清型BTV及鹿流行性出血热病毒(EHDV)进行检测,验证其特异性;同时,利用该方法检测血清模拟样品及抗病毒血清样品。结果:所设计的检测方法特异性好,与EHDV无交叉反应,可检测至少17个血清型BTV,并能有效检出不同病毒浓度的模拟样品及不同型的血清样品。结论:建立的RT-PCR方法可用于BTV群的特异性通用检测。     

抗沙门氏菌O_(16)因子特异性单克隆抗体的制备及其特性鉴定

用淋巴细胞杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗沙门氏菌Ⅰ群主因子(O_(16))单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系,并对其部分生物学特性进行测定。这些单抗不仅特异性强,而且反应效价高,其中以A—12—4单抗反应滴度最高,腹水ELISA效价为10~5,在pH 3—9范围内稳定,在-70℃至37℃反复冻融3次和在56℃3小时单抗的效价无明显下降。琼扩试验表明3株单抗亚类分别为IgM,IgG_1和IgG_3,用竞争ELISA试验证明,这3株单抗都是对同一抗原决定簇,都是针对Ⅰ群主因子抗原O_(16)。     

抗蓝舌病病毒VP7和NS2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为建立蓝舌病病毒(BTV)的检测方法和研究该病毒蛋白的功能,本研究利用BTV血清8型(BTV8)免疫BALB/c小鼠,取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,制备单克隆抗体(MAb).并以BTV8作为包被抗原建立间接ELISA方法,经筛选获得了8株稳定分泌抗BTV8 MAb的杂交瘤细胞株(1B2、1F6、2B1、2D10、3B6、3D9、4D4和4D12).Western blot结果显示,MAb 1F6、2B1、2D10、3B6、3D9与BTV8 VP7蛋白反应,MAb B2、4D4、4D12与BTV8 NS2蛋白反应.间接免疫荧光结果显示,该8株MAb与24型BTV血清型呈不同的反应论系.本研究所获得的MAb为建立BTV免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究提供了实验依据.     

鸭星状病毒单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备针对鸭星状病毒(Duck astrovirus,DAstV)衣壳蛋白的单克隆抗体,以DAstV C-NGB株为免疫原,用ORF2重组蛋白作为抗原进行筛选,获得7株稳定分泌抗DAstV ORF2蛋白单抗的杂交瘤细胞。取E5C1株和C10F6株进行鉴定,结果表明,2株单抗均为IgM,轻链均为κ型;细胞上清和小鼠腹水的效价分别为10~5和10~6以上;免疫印迹试验表明,2株单抗均能识别重组ORF2蛋白;特异性试验表明,E5C1株杂交瘤细胞的培养上清只与DAstV反应。     

单抗阻断ELISA检测流行性出血病病毒特异性抗体

应用流行性出血病(EHD)群特异性单克隆抗体(1G9/C9)建立了检测EHD病毒血清抗体的高度敏感和特异的阻断ELISA(B-ELISA),该法能检出所有6种参与试验的EHD血清型高免参考血清中存在的阻断抗体,而不受19种南非和8种澳大利亚蓝舌病病毒(BTV)血清型参考抗血清的影响。与间接ELISA(I-ELISA)相比,EHD B-ELISA检测EHD特异性敏感性更高。同时用BTV和EHD B-ELISA检测试验血清和田间血清的BTV和EHD血清抗体滴度。结果表明:只有B-ELISA对相应的血清群特异性抗体敏感,即便是继发和混和感染另一种病毒亦如此。     

抗鸡IgM(μ链)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与鉴定

以绵羊红血球免疫鸡,获得富含IgM的鸡血清。以提纯鸡血清IgM免疫BALB/C小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP 2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法进行筛选,共获得7株稳定分泌特异性抗鸡IgM杂交瘤细胞)TM18、TM21、TM25、TM34、TM57、TM62、TM65)。杂交瘤培养上清的ELISA效价为10~3～10~5,腹水型单克隆抗体的ELISA效价为10~5～10~7。7株单抗中TM57、TM65为小鼠IgM类,其余5株均为小鼠IgG_1亚类。间接ELISA和夹心ELISA试验表明,所有7株单抗只与鸡IgM反应,而不与鸡IgG和鸡IgA反应。7株单抗均能抑制鸡IgM对其特异抗原绵羊红血球的血凝作用。血凝抑制价为1∶2~3～2~7,7株单抗中只有TM65能在琼脂扩散试验中与鸡IgM出现沉淀线.     

禽IL-2单克隆抗体的制备与鉴定

为制备禽源IL-2的单克隆抗体,首先构建chIL-2的原核表达载体并进行表达,用HIS-IL-2蛋白免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,取小鼠脾与骨髓瘤细胞sp2/0融合,应用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤,最终获得3株稳定分泌chIL-2抗体的杂交瘤,分别命名为1C2,2F2和4B5。并对所获得单抗的特性进行了鉴定,结果表明,3株单抗亚型均为IgG1,抗体亲和力解离常数(K_d)分别为4.81×10~(-10)、1.36×10~(-10)、4.15×10~(-9),均为高亲和力抗体,经过Western Blot确定3株单抗分别识别chIL-2的不同区域,且均能特异性识别chIL-2。该单抗的制备为chIL-2的功能研究和应用奠定了基础。     

马立克氏病病毒单克隆抗体研究 Ⅰ.马立克氏病病毒和火鸡疱疹病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和鉴定

采用马立克氏病病毒(MDV)和火鸡疱疹病毒(HVT)感染细胞匀浆抗原免疫 BALB/C 小鼠,通过淋巴细胞杂交瘤技术获得了13件分泌 MDV 特异性单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。其中9株 McAb 对三个血清型毒株均呈阳性反应;BC_3对血清Ⅰ、Ⅲ型毒株反应阳性:CE_(11)和 CB_3对血清Ⅰ型毒株呈阳性反应;EE_(12)对血清Ⅲ型发生反应.13株 McAb 既具有 ELISA 特性(最高效价1:100000),     

猪瘟病毒单克隆抗体制备及病毒荧光检测研究

应用纯化的猪瘟病毒疫苗免疫Balb/c小鼠,以重组的E2和E0蛋白为检测抗原,筛选制备了17株抗猪瘟病毒的杂交瘤细胞株。用猪瘟病毒石门毒接种PK-15细胞,以制备的17株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验,结果显示有7株单抗呈现良好特异性荧光染色。     

血清4型禽腺病毒广西分离株单克隆抗体的制备及鉴定

为制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)广西分离株(FAdV-4-GX2018-005)的特异性单克隆抗体，将FAdV-4-GX2018-005作为免疫原免疫BALB/c小鼠后，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株。利用阳性杂交瘤细胞株制备腹水并纯化得到单克隆抗体，利用ELISA和IFA鉴定单克隆抗体的特异性。结果表明，成功获得3株单克隆细胞株3A3、13A11和4D5。3株杂交瘤细胞株分泌的抗体，能与FAdV-4产生特异性反应，与其他血清型禽腺病毒(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)不发生反应。本研究成功制备FAdV-4广西分离株单克隆抗体，为FAdV-4检测方法的建立奠定了良好基础。