黑凤鸡ChIFN-α基因克隆与序列分析

为进行黑凤鸡α干扰素(ChIFN-α)基因克隆与序列分析研究,笔者利用RT-PCR技术扩增黑凤鸡肝脏ChIFN-α基因,将其连接到pUCm-T载体上进行遗传转化,对重组子进行序列测定,同时利用ExPASy、BLAST、DNAStar等软件对ChIFN-α进行序列分析。结果表明:ChIFN-α基因长度为582 bp,编码193个氨基酸,分子质量为22. 116 ku,等电点为9. 06; ChIFN-α与已报道的其他鸡的IFN-α蛋白序列具有较高的同源性,与蓝孔雀首先聚类,其次是鸭、天鹅、雁等,与哺乳动物的亲缘关系较远; ChIFN-α具有干扰素α、β的匹配区域,同时含有其跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测ChIFN-α属于IFαβ超家族; ChIFN-α为分泌蛋白,前31个氨基酸为信号肽序列,不存在跨膜结构; ChIFN-α的二级结构主要以α-螺旋(61. 14%)和无规则卷曲(35. 75%)为主。     

三元猪β干扰素基因克隆与生物信息学分析

为了提高猪的抗病毒性,试验以三元猪(杜×长×大)为试验动物,提取猪肝脏的DNA,利用特异性引物PCR扩增三元猪β干扰素(IFN-β)基因,将其克隆到pGEM-T Easy质粒载体上,菌液PCR鉴定重组质粒后进行测序鉴定,同时对IFN-β进行了全面的生物信息学分析。结果表明:经PCR扩增获得了IFN-β全基因序列,其长度为682 bp;生物信息学分析显示三元猪IFN-β基因的开放性阅读框编码186个氨基酸残基,前21个为信号肽;三元猪IFN-β蛋白分子质量为21.97 ku,等电点为4.89;三元猪IFN-β与已报道的其他猪的IFN-β氨基酸序列具有较高的相似性;三元猪和马首先聚类,其次是人和猴,与鸡的同源性最低;三元猪IFN-β蛋白具有IFN-αβ的匹配区域,同时含有IFN-αβ受体复合物两个跨膜亚基IFNAR-1和IFNAR-2的结合位点,预测IFN-β蛋白属于IFN-αβ超家族。     

鸡α-干扰素基因的克隆与序列分析

试验采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从鸡脾淋巴细胞中扩增出鸡的α干扰素(ChIFN-α)基因,将包括ChIFN-α编码区的cDNA片段克隆到pMD 18-T载体中,并对该片段进行序列测定,序列分析表明克隆的ChIFN-α基因的开放阅读框(ORF)为582bp,与GenBank内已发表的ChIFN-α序列进行对比,同源性高达98.6%～99.8%。进一步分析各国家和地区上传至GenBank的ChIFN-α基因发现,ORF和编码的氨基酸长度一致,未见地域变化特征。     

鸡α干扰素基因的克隆和鉴定

采用反转录-聚合酶链反应技术，从传染性囊病病毒感染的鸡胚成纤维细胞中扩增出石岐杂鸡的α干扰素（spzChIFN-α)基因，将包括sqzChIFN-α编码区的cDNA片断克隆到pBssK载体中，并对该片断进行序列测定，核苷酸序列测定结果表明克隆的ChIFN-α基因cDNA片段长度为724bp，和其他ChIFN-α基因的同源性在9左.1%以上，与其它α食干扰素基因的同源性在67.4%以上，其中与鸭α干扰素基因的同源性为67.4%，与火鸡α干扰素基因的同源性为89.8%，推导的石岐杂鸡α干扰素氨基酸序列与其它禽类的α干扰素的同源性在49.2%以上，其中与白来航鸡α干扰素的同源性为96.9%-99%，与鸭和火鸡α干扰素同源性分别为49.2%和80.7%。     

牛干扰素刺激基因15的生物信息学分析

为了研究牛干扰素刺激基因15编码ISG15蛋白的结构及功能特性,笔者采用生物信息学方法对ISG15基因的开放阅读框进行分析,对ISG15蛋白的氨基酸组成、理化性质、二级结构、三级结构、互作蛋白、亲疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、抗原表位进行分析预测,选取不同动物ISG15蛋白氨基酸序列构建系统进化树。结果表明,该基因全长591bp,开放阅读框全长465 bp,编码154个氨基酸;ISG15蛋白由20中氨基酸构成,分子量为17.31 ku,等电点为6.73,属于酸性蛋白;不稳定系数为50.87,属于不稳定蛋白;二级结构分析显示,ISG15以β-折叠、无规则卷曲为主,均为31.82%;互作蛋白分析显示,ISG15与干扰素、干扰素刺激基因密切相关;ISG15是亲水蛋白,无跨膜结构及信号肽,主要分布于细胞质,细胞核、线粒体、内质网内亦有分布,并预测到7个潜在抗原表位。牛ISG15氨基酸序列与同属偶蹄目的牦牛、瘤牛关系最近,与灵长目类关系最远。     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

赤水乌骨鸡ExFABP基因序列生物信息学及组织表达分析

本研究旨在对赤水乌骨鸡的ExFABP基因编码区（Coding Sequence,CDS）序列进行测序及生物信息学分析，检测其在不同组织中的表达，探究ExFABP对赤水乌骨鸡肉质性能的影响。运用RT-PCR对赤水乌骨鸡ExFABP基因的编码区序列进行扩增测序，并对其氨基酸序列进行生物学特性分析，构建物种进化树揭示亲缘关系，同时通过实时荧光定量PCR检测了赤水乌骨鸡不同组织中ExFABP的差异表达情况。结果显示，赤水乌骨鸡ExFABP基因编码区长537 bp，编码178个氨基酸。赤水乌骨鸡ExFABP编码氨基酸序列与原鸡的同源性最高，达到100%。系统进化树分析表明，赤水乌骨鸡与原鸡的亲缘关系最近。ExFABP基因在各组织中均有表达，在肺脏中的表达量最高，显著高于其他组织，在胸肌中的表达量最低。研究结果为进一步研究改善赤水乌骨鸡肉品质、风味提供基础材料。     

无量山乌骨鸡HMOX1基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】扩增无量山乌骨鸡血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)基因CDS区并进行生物信息学分析,检测其组织表达特征,为后续该基因的功能研究奠定基础。【方法】以无量山乌骨鸡皮下脂肪组织cDNA为模板,PCR扩增HMOX1基因,连接PESI-T载体后进行测序分析,使用DNAMAN软件对所获序列进行翻译并与原鸡进行序列比对;使用BLAST、Mega 7.0、SOPMA、ProtParam和ExPASy等在线软件进行相似性比对、系统进化树构建、编码蛋白的理化性质及蛋白结构预测;利用STRING软件预测HMOX1互作蛋白;通过实时荧光定量PCR检测HMOX1基因在无量山乌骨鸡不同组织中的表达水平。【结果】无量山乌骨鸡HMOX1基因CDS区长为891 bp,编码296个氨基酸,与原鸡HMOX1基因(登录号：NM＿205344.1)核苷酸序列相比存在3处突变,其中2处为同义突变,第217 bp处G>C为错义突变,导致第73位的天冬氨酸突变为甘氨酸。HMOX1基因与原鸡和日本鹌鹑的氨基酸序列相似性较高(99.6%和95.0%),与马的相似性最低(60.2%)。系统进化树分...     

驯鹿干扰素β1基因的克隆及遗传进化分析

试验旨在从驯鹿鹿茸顶端组织中克隆干扰素β1(interferon beta 1,IFNβ1)基因全长序列,分析其分子特性,为研究其生物学活性及实际应用奠定基础。根据GenBank数据库中牛、羊等近缘物种IFNβ1基因的保守序列设计1对引物,以驯鹿鹿茸顶端间充质层组织基因组DNA为模板,采用PCR技术扩增得到驯鹿IFNβ1基因并克隆、测序,利用相关生物信息学软件对该序列进行分析。结果发现,驯鹿IFNβ1基因全长561bp,共编码186个氨基酸,含有3个糖基化位点;其编码蛋白含有4个α螺旋、4个β折叠区、7个β转角。将驯鹿IFNβ1基因推导的氨基酸序列与其他14种哺乳动物进行遗传进化分析发现,其同源性为45.1%~92.0%;驯鹿与其他动物IFNβ1基因序列分析和系统进化树分析表明,IFNβ1基因存在种属差异性,亲缘关系越近,同源性越高。本研究结果为驯鹿IFNβ1基因的进一步研究和应用提供了基础试验数据。     

兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列扩增及其生物信息学分析

本研究根据Genbank载入的普通绵羊血小板衍生生长因子受体样蛋白(PDGFRL)基因序列设计特异性引物。利用PCR技术扩增乌骨绵羊PDGFRL基因编码区片段,经测序后对序列进行比对分析,并采用生物信息学软件对编码区序列和蛋白质结构进行预测。结果表明:兰坪乌骨绵羊PDGFRL基因编码区序列全长1128bp,编码375个氨基酸;同普通绵羊进行核苷酸序列同源性比对发现同源性为99.73%,发现3个碱基同义突变;生物信息学分析表明不同物种PDGFRL基因编码区核苷酸序列与氨基酸序列具有较高的保守性;蛋白结构预测显示,PDGFRL蛋白空间结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲构成。     

中华蜜蜂气味结合蛋白5,9,11,12基因克隆及生物信息学分析

为了进一步研究中华蜜蜂气味结合蛋白的生理功能,研究克隆了中华蜜蜂气味结合蛋白5,9,11,12基因完整的基因组序列,并对其进行了多种生物信息学分析。结果表明:中华蜜蜂气味结合蛋白5,9,11,12基因分别编码143,132,143,150个氨基酸残基;蜜蜂气味结合蛋白的同源性较低;4种气味结合蛋白都有信号肽序列,其长度在22～24个氨基酸残基之间;气味结合蛋白9,11有跨膜区序列,而气味结合蛋白5,12没有预测到跨膜区序列。     

牦牛AQP9基因CDS全长序列克隆及其生物信息学特征分析

为了研究高原动物对青藏高原极端生境的适应机理,并为探讨高原动物适应机制提供基本数据。本研究运用基因克隆技术对牦牛脑AQP9基因CDS全长序列进行克隆,采用生物信息学方法进行分析,AQP9基因和编码序列特征进行了以下几方面的预测和分析:其物化性质、疏水性、跨膜结构和蛋白二级结构。结果表明,牦牛AQP9的CDS含有一个885bp的开放阅读框,编码295个氨基酸;牦牛AQP9基因编码蛋白分子量和理论等电点分别为31.89ku和6.21,其编码蛋白含有6次跨膜结构,属于疏水性蛋白;二级结构由α-螺旋、延伸链、β-折叠及无规则卷曲构成;牦牛AQP9基因编码氨基酸序列与黄牛、藏羚羊、绵羊等物种间同源性较高,系统进化情况与其亲缘关系远近一致。本研究将为牦牛低氧适应性研究提供一定的基础资料。     

中国荷斯坦奶牛铁蛋白基因3'端克隆及序列分析

本研究旨在克隆和分析中国荷斯坦奶牛的铁蛋白(FTH)基因,为该基因的功能研究和有效利用提供理论依据.运用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从公犊肝脏组织中扩增出FTH基因的3'端cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因的氨基酸序列进行分析.结果表明,FTH基因3'端cDNA全长为489 bp,编码81个氨基酸;经生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白无N端信号肽及跨膜区,相对分子质量为9.1253 kD,理论等电点为5.19,脂肪系数为85.56,总亲水性为-0.342,其一级结构中存在4个功能结构域;二级结构元件以α-螺旋和β-旋转为主;同源序列分析表明,中国荷斯坦奶牛与原牛FTH氨基酸的相似性最高(99％);系统进化树显示,在该基因座位上中国荷斯坦奶牛与所测物种的亲缘关系均较远.本研究有助于揭示FTH家族基因的进化历史,为对其进行深入的功能分析和利用研究提供参考.     

从江香猪γ干扰素基因克隆与序列分析

试验旨在研究从江香猪γ干扰素（interferon gamma,IFN-γ）基因克隆与序列分析。试验提取贵州从江香猪肝脏组织总RNA,反转录生成cDNA,采用2对特异性引物进行巢式PCR扩增从江香猪IFN-γ（CJ-poIFN-γ）基因编码区,将其克隆至pUCm-T载体上,获得重组质粒pUCm-CJpoIFN-γ,并测序鉴定;利用NCBI、SOPMA、SignalP-4.1等在线服务器软件、DNAStar软件对CJ-poIFN-γ进行序列分析。结果表明,CJ-poIFN-γ基因编码区长501 bp,编码166个氨基酸;核苷酸序列比对结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪、荣昌猪、印度猪、长白猪、内江猪同源性为99.4%~100.0%;进化树分析结果显示,CJ-poIFN-γ与梅山猪、剑白猪、藏猪、成华猪亲缘关系较近;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白不存在跨膜结构,为分泌蛋白,前23个氨基酸为信号肽序列;CJ-poIFN-γ基因编码蛋白二级结构主要以α-螺旋（50.60%）和无规则卷曲（33.14%）为主,B细胞表位主要位于62-65、84-87、113-115、144-156和162-166位氨基酸。试验结果为进一步研究IFN-γ的生物活性、加快从江香猪品种资源的有效利用奠定基础。     

陆川猪PLIN5基因的克隆和序列分析

为了研究陆川猪背最长肌围脂滴蛋白5(PLIN5,Perilipin5)基因的结构和功能,试验对陆川猪PLIN5基因进行RT-PCR扩增,所得产物经转化获得含目的基因的重组质粒pMD19-T-PLIN5,经菌落PCR扩增和测序鉴定正确后利用生物信息学方法对陆川猪PLIN5基因的结构、理化性质及其编码蛋白信号肽、跨膜结构、亚细胞定位等进行分析,并探讨了陆川猪与其他物种PLIN5氨基酸序列的进化关系。结果表明:PLIN5基因编码区(CDS)序列长度为1 377 bp,编码458个氨基酸,与NCBI上公布的野猪PLIN5基因序列中的编码区存在4个碱基差异,均为错义突变;陆川猪PLIN5蛋白不存在信号肽,没有跨膜结构域,不存在N糖基化位点;二级结构中α-螺旋占47.16%,无规则卷曲占43.67%,延伸链占9.17%;陆川猪PLIN5基因在不同物种及进化过程中具有较高的保守性,该基因编码的蛋白符合一般Perilipin超家族的结构特征。     

马鹿生长激素(GH)基因生物信息学预测及分析

为研究马鹿生长激素(GH)基因的结构和功能,从GenBank中下载马鹿、梅花鹿、鼷鹿、牛、山羊、绵羊、猪、人、黑猩猩、挪威大鼠、小家鼠、北极狐、狗、鸡和斑马鱼的GH基因完整编码区(CDS)及氨基酸序列,利用DNAStar 7.0、BioEdit 7.0生物软件与相关在线工具对马鹿GH基因核苷酸序列的基本信息及其编码蛋白的理化特性和结构特征进行了生物信息学预测及分析,对马鹿与其他14个物种GH基因的CDS序列及其编码氨基酸序列进行相似性分析,并基于氨基酸序列构建了15个物种的系统进化树。结果表明:马鹿GH基因DNA序列长度为2 100 bp,包括完整的5个外显子和4个内含子,部分5′UTR和3′UTR,CDS全长654 bp,编码217个氨基酸;其编码的蛋白是一种分子质量为24.588 4 ku,等电点为7.62的疏水性稳定碱性蛋白;存在2个强跨膜区、8个广泛磷酸化位点,二级结构元件以α-螺旋和无规则卷曲为主;该蛋白位于细胞外,含有1个信号肽,属一种分泌型蛋白;马鹿与梅花鹿、牛、绵羊、山羊和鼷鹿等动物的GH基因氨基酸序列相似性较高,亲缘关系最近。该研究结果可为马鹿GH基因的进一步分析提供详细的生物学基础信息。     

草鱼CD40基因编码区分子序列特征分析

为了研究CD40基因在草鱼出血病中的作用,笔者利用生物信息学分析方法对草鱼CD40基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、蛋白质二级结构、N-糖基化位点、信号肽、结构域等高级结构进行了预测。结果表明,草鱼CD40基因编码288个氨基酸残基,是一不稳定的可溶性蛋白;有2个潜在的N-糖基化位点、存在1个典型的跨膜螺旋区;编码蛋白质的二级结构是以无规则卷曲和β-折叠为主的混合型蛋白。     

猪硬脂酰辅酶A去饱和酶蛋白生物信息学分析

为了探究硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的结构和生物学功能,利用Expasy、Sopma等生物信息学软件,对猪SCD的氨基酸序列进行初步的生物信息学分析。结果表明:猪SCD基因编码359个氨基酸,平均分子质量为41.38 ku;该蛋白存在4个跨膜结构域,分别包含1个潜在的O-糖基化位点、3个N-糖基化位点和16个磷酸化位点;二级结构由α螺旋、β转角、延伸链和随机卷曲组成;该蛋白具有低复杂结构和跨膜结构两种功能结构域。     

副猪嗜血杆菌OMP5 基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank 上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5 基因的核苷酸序列,设计1 对特异性引物,对贵州省HPS 分离株OMP5 基因进行扩增。结果表明所扩增的OMP5 基因的长度为1116 bp,与SH0165 株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为100%。生物信息学分析结果表明,OMP5 基因所编码的外膜蛋白P5 的理论等电点pI为9.34,不稳定系数为20.44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83.94,总体平均亲水性为-0.172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21 个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22 个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。     

副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆及生物信息学分析

根据GenBank上公布的副猪嗜血杆菌外膜蛋白OMP5基因的核苷酸序列,设计1对特异性引物,对贵州省HPS分离株OMP5基因进行扩增。结果表明所扩增的OIvIP5基因的长度为1116bp,与SH0165株对应的核苷酸序列和氨基酸同源性均为lOO％。生物信息学分析结果表明,OMP5基因所编码的外膜蛋白P5的理论等电点pl为9．34不稳定系数为20．44,推测其为稳定性蛋白;脂肪指数为83．94,总体平均亲水性为-0．172,推测该蛋白是一种亲水性蛋白;该蛋白含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,无跨膜区,最前端的21个N-末端氨基酸残基为信号肽序列并且主要为疏水性氨基酸,最佳切割位点在第21～22个氨基酸之间;结构位点预测表明该蛋白含有多个不同的糖基化和磷酸化位点。