鸡基因Ⅶ型新城疫病的诊治

2005年10月～2006年06月,吉安县爆发一种引起雏鸡、育成鸡高死亡率,产蛋鸡群产蛋下降的烈性传染病.发病特点是流行面广,发病率高,死亡率高.经流行病学调查、病毒分离及F-基因的定型,诊断这场疫病是由基因Ⅶ新城疫病毒引起的.     

鸡新城疫病毒基因Ⅶ型和LaSota株灭活疫苗免疫保护效力观察

新城疫是危害我国养禽业的重要疫病之一,新城疫病毒(NDV)流行毒株有多种基因型,其中基因Ⅶ型毒株流行较为普遍。本研究利用流行病学调查中筛选出的NDV LY1分离株(基因Ⅶ型)和传统的LaSota株(基因Ⅱ型)与油佐剂按1∶3比例混合乳化,分别制成油包水型LY1、LY1+LaSota和LaSota油乳剂灭活苗。免疫试验结果显示,LY1灭活疫苗组HI抗体效价较低,LY1+LaSota疫苗组HI抗体水平稍高于商品化LaSota疫苗组(P>0.05),抗体产生规律相似;利用LY1分离株攻击,LY1+LaSota株组免疫保护率达100%,明显高于LY1分离株灭活疫苗组及商品化灭活疫苗组。本试验为新城疫新的疫苗研究开发奠定了基础。     

基因Ⅶ型新城疫病毒分离鉴定及免疫原性研究

旨在分离筛选免疫原性好的新城疫病毒(NDV)流行毒株。从发病鸡组织中分离到4株病毒,经血凝和血凝抑制试验鉴定为NDV,进而完成致病指数测定、F基因高变区测序和遗传进化分析,并通过鸡胚交叉中和试验和攻毒试验研究PLK-N-06株对比La Sota疫苗株的抗原差异和免疫保护效力。结果显示,4个分离株的致病指数均属速发型NDV范围,且PLK-N-06株毒力最强;F蛋白裂解位点均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。遗传进化分析表明,分离株均为Ⅶd亚型。交叉中和试验结果显示,PLK-N-06株和La Sota株存在显著的抗原性差异。用PLK-N-06株油乳剂灭活苗免疫接种SPF鸡后产生的HI抗体效价几何平均值为1∶338,显著高于La Sota疫苗(1∶69),且其对PLK-N-06株感染的排毒率为0/10,明显低于La Sota株油乳剂灭活苗的4/10,结果表明PLK-N-06株具有良好的免疫原性,为新城疫基因Ⅶ型新型疫苗的研发奠定了基础。     

基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒的制备与鉴定

利用Bac-to-Bac昆虫-杆状病毒表达系统分别构建了含有新城疫强毒株M、F、NP和HN等4个结构基因的单顺反子重组杆粒,经转染后,观察Sf9细胞病变以及PCR鉴定结果表明成功构建了4种重组杆状病毒;收集重组杆状病毒采用共感染策略,Sf9细胞上清经超速离心,蔗糖密度梯度纯化与浓缩后,利用Western blotting方法和透射电子显微镜技术检测,结果表明目的蛋白均正确表达且组装成具有完整囊膜形态的病毒粒子。     

基因Ⅶ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据基因ⅤⅡ型新城疫病毒F基因裂解位点特征设计一对引物和TaqMan探针,建立一种敏感、特异、重复性良好的基因ⅤⅡ型毒株荧光定量RT-PCR鉴别检测方法。以体外转录法制备的cRNA标准品为标准阳性模板,构建标准曲线,并进行各项指标的检测。结果表明,建立的方法特异性良好,最低可检测到102拷贝·μL-1的模板RNA,敏感性比普通RT-PCR高100倍。本试验建立了基因ⅤⅡ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法,且该方法能够鉴别检测常规方法不能区分的新城疫病毒基因ⅤⅡ型强毒株,表明本研究建立的方法可用于此种基因型毒株的快速鉴别检测。     

基因Ⅱ、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的制备和鉴定

将基因Ⅶ型新城疫NA-1株F、HN基因的胞外域与基因Ⅱ型新城疫Lasota株F、HN基因的胞内域及跨膜域进行融合,并命名为rNA-1 F/HN。利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有新城疫LaSota株M、F、HN等3个结构基因及rNA-1F、rNA-1 HN基因的重组杆状病毒rBV-LaSota M、rBV-LaSota F、rBV-rNA-1 F、rBV-LaSota HN、rBV-rNA-1 HN。将几种重组杆状病毒共感染Sf9细胞96h后收取上清,经超速离心及蔗糖密度离心纯化病毒样粒子(virus-like particles,VLPs),并利用Western blot方法和透射电子显微镜技术检测,结果显示目的蛋白均正确表达且组装成与野生型NDV形态大小相似的VLPs。结果表明:成功制备了新城疫标准疫苗株(LaSota株)及流行强毒株(NA-1株)二价NDV VLPs,为当前新城疫的防控提供新策略。     

鸡新城疫病毒不同浓缩方法的比较

病毒的浓缩与纯化是病毒分子生物学和生物制品研究的主要内容,也是疾病诊断的常用 技术.超速离心法、密度梯度离心、超过滤法、层析法等提纯浓缩病毒的效果好,但其对设 备要求较高,而且操作较为复杂,难以在基层推广应用.而采用透析袋、红细胞吸附释放法 对新城疫病毒进行浓缩、提纯无需特殊设备,其操作简便,使浓缩后的病毒含量及纯度有了较大的提高,也便于进行该类病毒病的诊断与研究.     

新城疫病毒人工感染鸡诱导胸腺和法氏囊细胞凋亡的初步研究

本研究用新城疫病毒(NDV)参考强毒株F48E8感染鸡,通过光镜和电镜观察鸡的胸腺和法氏囊淋巴绌胞凋亡的形态学特征,并进行统计学分析。NDV感染鸡后,其胸腺和法氏囊淋巴细胞凋亡数量显著增加(P＜0．01)。实验结果说明NDV参考强毒株F48E8人工感染鸡后可以诱导胸腺和法氏囊淋巴绌胞凋亡。     

反向遗传技术致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒对SPF鸡的免疫效力评价

为评估致弱的基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)的免疫效力,本研究采用反向遗传技术构建的一株基因Ⅶ型NDV减毒疫苗株(MG7株),通过滴鼻点眼接种4周龄SPF鸡后,检测其体液免疫、细胞免疫以及攻毒后保护效率和排毒情况等指标,评价MG7株的免疫效果。结果表明:MG7株免疫3周后,能够诱导SPF鸡抗体的产生,且抗体水平(6.08log_2)高于La Sota株免疫组(5.2log_2)。MG7株免疫1~3周内,PBMCs中CD8α+T淋巴细胞亚群比例呈逐渐上升趋势;MG7免疫后第3周,PBMCs中CD4~+T淋巴细胞亚群的比例明显增加(p0.05);同时,MG7株免疫组的血清IFN-γ含量也呈递增趋势,与空白对照组存在极显著差异(p0.01)。此外,以基因Ⅶ型NDV强毒株进行攻毒试验,在攻毒后第2 d~6 d,MG7株免疫组SPF鸡未检测出排毒;LaSota株免疫组则存在不同程度排毒现象,而空白对照组全部死亡。实验表明,与LaSota株免疫组相比,MG7株能够有效诱导NDV特异性抗体产生和T细胞免疫反应,提高SPF鸡的保护效率和有效阻止排毒。本研究对MG7株免疫效力的评估结果表明其具有作为新型基因Ⅶ型NDV疫苗株的潜力,有助于我国ND的防控和根除。     

基因Ⅶ型新城疫病毒样颗粒作为疫苗候选株的免疫效果

利用昆虫细胞/杆状病毒表达载体系统,将已构建编码新城疫病毒(NDV)M、F和HN结构基因的3种单顺反子重组杆粒共感染悬浮培养的Sf9细胞以大量制备新城疫病毒样颗粒(ND VLPs)。收集细胞培养上清经超速离心浓缩,蔗糖密度梯度纯化后,利用Western blot检测和透射电镜观察。结果显示,3种目的蛋白均正确表达且组装形成与原病毒粒子形态相似的颗粒,测定其血凝活性效价可达12log2。动物试验结果表明,与LaSota灭活油乳苗相比,将纯化后的病毒样颗粒以含25μg蛋白的剂量或联合佐剂免疫商品蛋鸡后能产生较高水平的HI抗体,且可有效减少攻毒鸡只口咽、泄殖腔途径的排毒时间,从而减少病毒在健康鸡群中的传播感染机会;表明所研制的基因Ⅶ型ND VLPs可作为疫苗候选株具有很大的防控优势。     

1株Ⅶ型新城疫病毒融合蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了研究Ⅶ型新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）CY1株的进化情况,分析其遗传变异和基因功能,试验应用RT-PCR扩增NDV辽宁分离株CY1株的融合蛋白(fusion,F)基因,进行测序分析,构建系统进化树,并用生物信息软件对蛋白结构功能进行分析。结果显示,NDV F基因全长1662 bp,编码553个氨基酸。生物信息学分析结果表明,F蛋白的分子质量为58991.0 u,理论等电点为8.48,半衰期为30 h（哺乳动物类网状细胞）,不稳定系数31.62,脂肪指数为108.12,总平均疏水性0.174,最大疏水性为3.078,最小疏水性为-2.578,信号肽序列为第1-31位氨基酸残基,跨膜区结构分析结果表明该蛋白为跨膜蛋白,预测可能含有6个N-糖基化作用位点、9个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、7个蛋白激酶C磷酸化位点、14个N-豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点、1个亮氨酸拉链、1个微体C端靶信号位点、1个双向核定位信号。系统进化分析结果表明,NDV CY1株与zj1株进化距离最近。     

鸡基因VⅡ型新城疫病的诊治

<正>2005年10月～2006年06月,吉安县爆发一种引起雏鸡、育成鸡高死亡率,产蛋鸡群产蛋下降的烈性传染病。发病特点是流行面广,发病率高,死亡率高。经流行病学调查、病毒分离及F—基因的定型,诊断这场疫病是由基因VⅡ新城疫病毒引起的。     

2008年江苏地区基因Ⅶd亚型新城疫病毒遗传变异分析

为了研究基因Ⅶ d亚型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的分子流行病学及遗传变异规律,作者对2008年分离自江苏地区16株具有一定代表性NDV分离株的F和HN基因片段进行了扩增.根据F基因和HN基因序列绘制的2个遗传进化树基本一致,表明分离株中不存在囊膜糖蛋白基因发生重组的NDV;同时,HN蛋白线性表位发生E347K突变的变异株的分离率在我国呈上升趋势.基因Ⅶd亚型变异株的出现应引起相关领域从业者们的高度重视.     

鸡新城疫病毒内蒙古地方株F基因遗传变异分析

将3株新城疫病毒(NDV)内蒙分离株纯化培养后,提取病毒RNA,经RT-PCR扩增F基因,并测定出F基因的全部核苷酸序列为1662bp,编码有554个氨基酸残基。与国内外发表的部分NDV的F基因核苷酸序列进行比较,结果表明这3株分离株核苷酸同源性分别为97.5%,97.9%和98.0%,与标准毒株F48E9的同源性分别为85.8%,86.4%和86.8%,与长春、河北、山东、广东、广西、浙江、韩国等地的NDV的同源性在96.3%~98.8%之间。并且这3株分离株F蛋白的裂解位点氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,具有典型的强毒株裂解位点的特点。     

基因Ⅶ型新城疫病毒蛋鸡分离株的生物学特性及全基因组序列分析

对广东某蛋鸡场新城疫病毒分离株(命名GD0526)进行生物学特性研究及全基因组序列分析,结果显示该分离株具血凝活性,能被特异性新城疫病毒标准阳性血清所抑制,动物回归试验出现新城疫典型症状。该毒株MDT为43.38h、ICPI为1.73、IVPI为2.37,F基因裂解位点为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株特征。抗体增长规律和免疫交叉保护试验说明该毒株免疫原性较好,能产生较高水平的抗体,对试验鸡提供很好的保护。全基因组克隆和测序分析表明该毒株全基因组长15192bp,属基因Ⅶd型,与Shangdong-02-2010株核苷酸序列具有很高的同源性,而与LaSota株的相似性较低。     

鸡源AID基因的克隆及其抗新城疫病毒作用

APOBEC家族成员中AID蛋白具有DNA/RNA编辑酶功能,同时具有抑制病毒增殖的作用,但具体机制尚不明了。本研究首先根据NCBI公布的鸡全基因组序列进行生物信息学分析,预测鸡AID的基因序列并通过设计PCR引物,成功在鸡法氏囊cDNA样品中扩增出鸡AID基因(chAID)。通过建立并优化chAID的实时定量RT-PCR(rRT-PCR)检测方法,对鸡体内AID基因的表达以及其分布情况进行检测;同时通过Western blot试验对chAID蛋白在鸡细胞中的表达进行检测。试验显示,chAID基因能够在鸡细胞以及组织脏器中正常表达。新城疫病毒(NDV)感染鸡原代成纤维细胞、淋巴细胞后能够引起内源性chAID基因水平的上调;SPF鸡感染NDV后,chAID基因在不同组织脏器中均出现上调现象,以免疫器官最为显著。为了进一步验证chAID基因对NDV增殖的影响,进一步检测在细胞中过表达chAID基因对NDV增殖的影响。研究结果表明:重组chAID蛋白具有抗NDV病毒活性,本研究为进一步研究鸡chAID奠定了基础。