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1.
RT—PCR一步法检测鸡传染性支气管炎病毒的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
根据已发表的IBVS基因核苷酸序列,自行设计合成了一对跨幅约0.9kb的引物。该区段包括了S1基因C末端的400bp和S2基因N末端的500bp。用该引物对5株IBV参考毒株Gray、M41、H120、H52和MA5进行RT-PCR一步法扩增均获得预期的PCR产物,该引物的RT-PCR灵敏度检测结果表明,可以检测出0.112pg/μL的模板。用该引物对30个地方分离株进行检测,18株呈阳性,与鸡胚传代及电镜观察结果一致。 相似文献
2.
为了能快速准确地对禽流感进行病原学诊断,根据流感病毒的M基因序列,在保守区内用Olig04.0软件设计了1对引物,建立了一步法RT—PCR诊断方法,其目的片段大小为229bp。通过对不同稀释倍数的H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行检测,结果显示,病毒尿囊液的最低检出稀释度为1:10^4;阳性棉拭子的最低检出稀释度为1:2^3。用病毒分离法和一步法RT—PCR同时检测人工感染鸡不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,二者符合率为100%,但前者的检测灵敏度比后者高10~100倍。用该方法检测H1~H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,所有禽流感病毒均有229bp的目的条带出现,而其他14种禽病病原均无目的条带出现,表明该方法的特异性好。 相似文献
3.
传染性支气管炎病毒RT-PCR方法的建立 总被引:2,自引:0,他引:2
传染性支气管炎病毒 (IBV)的主要结构蛋白有 3种 ,纤突蛋白 S、膜蛋白 M和核蛋白 N。S蛋白由 S1和 S2 2部分组成 ,其中 S1蛋白的进化最为活跃 ,是 IBV具有众多血清型的基础。 S1蛋白的活泼表现源于 S1基因容易发生插入、缺失和不同毒株基因间重组。因此 ,围绕着 S1基因的研究工作就成为 IBV研究的热点 [1~ 3 ]。研究 IBV基因组结构的基本手段之一是建立有效的反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)以扩增出所需要的基因片段 ,由于 IBV基因组结构比较特殊 (核酸片段较大 ,碱基分配不均匀 ,G C含量较低 ) ,其 RT-PCR方法的建立十分困… 相似文献
4.
一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究 总被引:6,自引:0,他引:6
根据已发表的禽呼肠孤病毒(ARV)S1133株S1基因序列,设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株,分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增,即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物,而对照样品的扩增全为阴性;该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA,还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA,表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。 相似文献
5.
《中国兽医学报》2016,(10):1701-1705
为了快速检测临床样品中新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的混合感染,根据NDV的F基因和IBV的N基因保守序列分别设计了2对特异性引物,优化双重RT-PCR反应条件,建立了可同时检测NDV和IBV的快速双重反转录PCR(RT-PCR)诊断方法。敏感性试验表明,此方法对NDV和IBV的RNA最小检出量分别为0.014 3和0.013 6ng;NDV的扩增片段大小为459bp,IBV的扩增片段为282bp。对其他病毒如IBDV、AIV和EDSV的检测结果均为阴性,表明此方法具有较好的特异性。对58份临床疑似样品进行检测,NDV和IBV的阳性率分别为44.82%和31.03%,NDV和IBV混合感染率为20.68%,表明本研究建立的NDV与IBV双重RT-PCR检测方法,可用于临床发病病料中NDV和IBV混合感染的快速鉴别诊断。 相似文献
6.
《中国兽医杂志》2019,(8)
为快速检测禽腺病毒-Ⅰ群(FAV-I)感染,且能有效区分常见混合感染的新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV),本研究建立了多重PCR诊断方法。根据GenBank发表的FAV-Ⅰ的Hexon基因、NDV的F基因和IBV的N基因分别设计了3对特异性引物,通过对引物浓度、退火温度等反应条件的优化建立多重PCR诊断方法,并对该方法进行了特异性和敏感性研究,且对临床样本进行检测。结果发现,本研究建立的多重PCR方法可准确扩增出大小为895 bp(FAV-I)、1 600 bp(IBV)和529 bp(NDV)的特异性片段;3种引物最佳浓度分别为3 pmol/μL、3 pmol/μL和6 pmol/μL,最佳退火温度为55℃;该方法对3种病毒的最低检测限分别为1.46×10~5拷贝/μL、8.93×10~2拷贝/μL和2.11×10~4拷贝/μL;且该方法不能扩增出减蛋综合征病毒、马立克病毒、鸡传染性贫血病毒和H9亚型禽流感病毒等,临床样品检测结果与单项PCR结果相同。表明本研究建立的多重PCR检测方法具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可有效地区分FAV-I、NDV、IBV。 相似文献
7.
新城疫 (ND)、传染性支气管炎 (IB)、传染性喉气管炎 (ILT)和鸡毒支原体 (MG)是四种严重危害养鸡业发展的常见呼吸道传染病 ,在世界许多国家广泛流行。这几种鸡呼吸道传染病的流行病学、临床特征和病理变化十分相似。临床上 ,一个鸡群同时感染二种上述呼吸道传染病病原体的现象也常有发生。常规的病原分离鉴定、血清学方法难以对两种上述病原混合感染的鸡呼吸道传染病作出快速鉴别诊断。聚合酶链式反应 (PCR)技术具有快速、简便、特异及敏感等特点 ,近年来在禽病诊断中已得到了广泛应用。但常规PCR技术一次扩增只能诊断一种… 相似文献
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9.
本文建立了一种同时检测NDV和IBV二种病原体的多重PCR。根据NDV和IBV的基因文库,设计了两对分别与NDV与IBV某段基因序列互补的引物,用这两对引物对同一样品NDV和IBVRNA模板进行多重RT-CPR扩增,结果均得到了两条特异性大步与实验设计相符的310bp和1720bp多重的RT-CPR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性,敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能同 相似文献
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应用多重聚合酶链反应同时检测鉴别鸡新需疫病毒,鸡传染性支气管炎病毒,鸡 总被引:11,自引:1,他引:11
本文建立了一种同时检测DNV、IBV、和MG4种病原体的多重PCR技术。根据NDV、IBV、ILTV和MG的基因文库,设计了4对分别与NDV、IBV、ILTV和MG某段基因序列互补的引物,用这4对引物对同一样品中的NDV、IBV、ILTV、MGRVA和DNA模板进行多重PCR扩增,结果均同时得到了4条特异性大小与实验设计相符的310bp(NDV)、1720bp(IBV)、647bp(ILTV)和732bp(MG)多重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,该多重PCR技术难检出10pg的IBV、1bg的NDV RNA模板和ILTV、1pg的MG DNA模板。 相似文献
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旨在建立一种快速、准确检测H4亚型禽流感病毒(AIV)的方法,针对H4亚型AIV HA基因保守序列,设计并筛选出2对特异性引物,通过优化反应条件,建立了H4亚型AIV套式RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该法可特异性检测出H4亚型AIV,对其他常见禽病病原体无交叉;敏感性试验结果显示,该法对H4亚型AIV检测下限为360fg/μL;用该法对106份临床样品进行检测,临床样品检测结果与病毒分离结果一致。本研究建立的套式RT-PCR方法为H4亚型AIV的早期诊断及有效防控提供了快速、特异和敏感的检测方法。 相似文献
13.
本研究针对AIV H5的血凝素(HA)基因和vNDV的融合蛋白(F)基因设计两对引物,建立了单管同时检测AIVH5和vNDV的双重RT-PCR(dRT-PCR),该方法能在单一反应管内同时检测AIVH5和vNDV,不与其它亚型AIV、弱毒NDV毒株以及其它病原体发生非特异性扩增;对含有AIV H5 HA基因和vNDV F基因重组质粒DNA的最低检测限分别为20.6和406fg,敏感性与单项RT-PCR相同;从样本处理到报告结果仅需5h。对24份临床疑似样本进行检测,AIVH5均为阴性,vNDV阳性18份,PCR产物测序证明为靶基因序列,其具有vNDV F基因的特征性序列,随机选9份vNDV阳性样本接种SPF鸡胚,分离出6株vNDV,病毒分离率为6/9;对100 ELD50的AIV H5N1和100 ELD50的vNDV人工同时感染5日龄SPF鸡的脑、肝脏、肺脏和泄殖腔棉拭子进行dRT-PCR检测,AIV H5的检测率为4/5,3/5,5/5,4/5,vNDV的检测率为3/5,5/5,4/5,3/5,而对H9N2和LaSota毒株实验同时感染样本及阴性对照样本的检测均为阴性。可见本研究建立的dRT-PCR为AIV H5和vNDV诊断、监测、检疫及分子流行病学调查提供了特异性强、操作简单、检测速度快、成本低廉的新方法。 相似文献
14.
根据禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp(ARV)、264bp(AIV)、362bp(NDV)和459bp(IBV),且特异性、敏感性良好,能够检出1pgAIV和10PgARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。 相似文献
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禽流感、新城疫、传染性支气管炎三联没乳剂灭活疫苗的研制 总被引:1,自引:0,他引:1
以禽流感病毒(AIV)H5N4株,新城疫病毒(NDV)LaSota株与传染性支气管炎病毒(IBV)M41株为抗原研制了AI-ND-IB三联油乳剂灭活疫苗,并对疫苗的物理性状,安全性,免疫效力,保存期及抗体消长规律进行了检测,结果表明,疫苗在免疫后3周后6个月内,对AIV-H5N4,NDV-北京株的攻击均获全部保护,在免疫后52周内,免疫鸡箅清中AIV-N5N4,MDV,IBV的HI抗体也保持较高的水平,疫苗在4℃保存15个月,其免疫力没有下降。 相似文献
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应用三重聚合酶链反应同时检测NDV、IBV、MG的研究 总被引:14,自引:1,他引:13
本文建立了一种同时检测NDV、IBV和MG三种病原体的三重PCR技术。根据NDV、IBV和MG的基因文库,设计了三对分别与测NDV、IBV和MG某段基因序互补的引物,用这三对引物对同一样品中的测NDV、IBV、MG核酸模进行多重PCR扩增。结果均同时得到了三条特异性大小与实验设计相符的310bp(NDV)、1720bp(IBV)和732bp(MG)多重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,多重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和1pg的MG DNA模板。 相似文献
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为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。 相似文献
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为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV) HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。 相似文献
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HE Ying XIE Zhi-xun LUO Si-si LI Meng XIE Li-ji DENG Xian-wen XIE Zhi-qin FENG Bin HUANG Jiao-ling ZHANG Yan-fang 《中国畜牧兽医》2017,44(7):2126-2131
In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV. 相似文献