一步法多重RT-PCR检测新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和传染性法氏囊病病毒方法的建立和应用

根椐GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒[AIV(H9)]和传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的NDV、AIV(H9)和IBDV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增NDV的466bp、AIV(H9)的685bp和IBDV的244bp的特异性片段,而对其他4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10pg的NDV、10pg的AIV(H9)和1pg的IBDV模板。用53份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速及准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

鸡IBV、NDV和AIV多重RT-PCR检测方法的初步建立

根据鸡传染性支气管炎病毒M基因、禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,初步建立了针对鸡传染性支气管炎(IB)、新城疫(ND)和禽流感(AI)的多重RT-PCR鉴别诊断方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的3对引物可对同一样品中的IBV、NDV和AIV进行特异性扩增,所扩增的目的片断的长度分别为333bp(IBV)、438bp(NDV)和196bp(AIV);建立的多重RT-PCR检测方法能够检测出1ng/μLAIV、1ng/μLNDV和10ng/μLIBV的cDNA,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。本研究所建立的多重RT-PCR方法可用于上述3种鸡病毒性呼吸道疾病的快速鉴别诊断,在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

检测鸡新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒双重RT-PCR的建立与初步应用

为了快速检测临床样品中新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的混合感染,根据NDV的F基因和IBV的N基因保守序列分别设计了2对特异性引物,优化双重RT-PCR反应条件,建立了可同时检测NDV和IBV的快速双重反转录PCR(RT-PCR)诊断方法。敏感性试验表明,此方法对NDV和IBV的RNA最小检出量分别为0.014 3和0.013 6ng;NDV的扩增片段大小为459bp,IBV的扩增片段为282bp。对其他病毒如IBDV、AIV和EDSV的检测结果均为阴性,表明此方法具有较好的特异性。对58份临床疑似样品进行检测,NDV和IBV的阳性率分别为44.82%和31.03%,NDV和IBV混合感染率为20.68%,表明本研究建立的NDV与IBV双重RT-PCR检测方法,可用于临床发病病料中NDV和IBV混合感染的快速鉴别诊断。     

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒（ARV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）和鸡传染性支气管炎病毒（IBV）的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验。该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199bp（ARV）、264bp（AIV）、362bp（NDV）和459bp（IBV）,且特异性、敏感性良好,能够检出1pgAIV和10PgARV、NDV、IBV的RNA。临床应用结果证明,该体系具有很高的实用价值和应用前景。     

鸡传染性支气管炎病毒变异株ZZ2004 RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) ZZ2004 3a、3b及E基因序列,设计1对引物,扩增540 bp特异性核酸片段,建立了检测IBV ZZ2004的RT-PCR方法.特异性试验结果表明,IBV ZZ2004能扩增出540 bp的核酸片段,而IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现.敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1.525 pg的模板.上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强.利用建立的RT-PCR方法对从河南省分离的6株疑似鸡IBVZZ2004进行检测,结果5株为阳性.该方法的建立为IBV ZZ2004的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法.     

禽四种病毒多重PCR诊断技术的建立和应用

根据禽呼肠孤病毒(ARV)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的基因保守区设计了4对特异性引物,建立了针对四种病毒的多重PCR检测体系,并对该体系进行了条件优化及特异性、敏感性试验.该体系扩增的四种病毒基因片断大小分别为199 bp(ARV)、264 bp(AIV)、362 bp...     

禽流感与新城疫二联RT—PCR诊断方法的建立及其应用

根据禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)基因组序列高度保守区，设计合成了2对引物，以AIV、NDV培养物提取RNA并反转录，进行RT-PCR特异性片段扩增，扩增的片段大小分别为470和320bp。结果，扩增产物与设计的2对引物之间的序列大小一致。通过特异性与敏感性试验，AIV、NDV培养物均可扩增至10^-4，表明本方法对2种病毒具有快速、特异和高度敏感的特点。     

禽流感病毒和新城疫病毒二联RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(AIV)和新城疫病毒(NDV)的基因序列及其相关的RT-PCR检测方法,根据禽流感病毒M蛋白基因和新城疫病毒NP基因各设计一套特异性通用引物,扩增目的带分别为600bp和340 bp。通过对相关病毒检测,建立了AIV和NDV通用型二联RT-PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可为AIV和NDV的检测、流行病学调查及疫苗使用等奠定基础。     

应用三重聚合酶链反应同时检测NDV、IBV、MG的研究

本文建立了一种同时检测NDV、IBV和MG三种病原体的三重PCR技术。根据NDV、IBV和MG的基因文库,设计了三对分别与测NDV、IBV和MG某段基因序互补的引物,用这三对引物对同一样品中的测NDV、IBV、MG核酸模进行多重PCR扩增。结果均同时得到了三条特异性大小与实验设计相符的310bp（NDV）、1720bp(IBV)和732bp(MG)多重PCR扩增带,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性;敏感性测定结果表明,多重PCR技术能检出10pg的IBV、1pg的NDV RNA模板和1pg的MG DNA模板。     

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）793／BS1基因序列，设计1对引物，扩增891bp特异性核酸片段，建立了检测IBV793／B的RT—PCR方法。特异性试验结果表明，IBV793／B能扩增出891bp的核酸片段，而IBVM41H120H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明，本试验所建立的RT—PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT—PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793／B进行检测，结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793／B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。     

几种主要禽疫病诊断基因芯片的制备及初步应用

进行了几种主要禽疫病诊断基因芯片制备及其初步应用研究。试验分别设计和克隆鉴定了NDV、IBV、AIV和IBDV的靶基因重组质粒。以克隆的靶基因重组质粒为模板。分别进行PCR扩增制备靶基因并纯化，以基因芯片点样仪将制备的靶基因点制在氨基化的基片上，经干燥、水合、紫外线交联和洗涤后，成功制备了NDV-IBV-AIV-IBDV诊断基因芯片。试验应用CY3荧光标记制备的探针进行芯片的检验，结果表明制备的NDV-IBV-AIV-IBDV诊断基因芯片质量好，可对NDV、IBV、AIV和IBDV进行诊断检测，具有检测灵敏性好，特异性高和芯片可重复检测的优点。试验对30个临床样品进行初步应用检测，结果表明该诊断基因芯片技术与RT—PCR检测技术检出率基本一致，并具有同步诊断检测多种疫病的优点。     

禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank发表的禽副黏病毒4型（APMV-4）基因组序列,在保守区域分别设计了特异性RT-PCR引物和荧光探针,初步建立了可用于检测APMV-4的荧光RT-PCR方法。特异性试验表明本方法特异性强,与新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、减蛋综合征病毒（EDSV）等没有交叉反应。灵敏度试验表明本方法的检测下限为1EID50,比常规RT-PCR的敏感度高100倍左右。本研究所建立的荧光RT-PCR方法具有快速、准确、灵敏等优点,可用于APMV-4样品的检测。     

Serosurvey of five viruses in chickens on smallholdings in Bangladesh

A serologic survey was undertaken in chickens in smallholdings in Bangladesh for avian influenza A virus (AIV), egg drop syndrome '76 virus (EDS'76V), infectious bronchitis virus (IBV), Newcastle disease virus (NDV) and reovirus (RV) in three phases: January 2002-May 2003, September 2003-August 2004, and August 2005-March 2006. Four hundred thirty-six sera collected in the 2nd phase, 295 in the first phase, 755 in the 1st plus 2nd phases and 295 in the 1st phase were investigated for AIV, EDS'76V, IBV and RV, respectively, using enzyme linked immunosorbent assays. All 854 sera collected in the three phases were screened for NDV using hemagglutination inhibition test. In chickens 20% were seropositive to AIV, 3% to EDS'76V, 74% to IBV, 88% to NDV, and 47% to RV. The seroprevalence in flocks was 23% to AIV, 6% to EDS'76V, 79% to IBV, 89% to NDV and 56% to RV. Twenty-five percent chickens had > or = 10log(2)HI titers to NDV.     

禽类基因工程重组干扰素研究进展

近年来 ,多种禽类干扰素基因已被克隆和在大肠杆菌中表达。禽类基因工程重组干扰素在抗马立克病毒、劳斯肉瘤病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒和禽流感病毒方面效果显著 ,展现出了广阔的应用前景。文章对禽类基因工程重组干扰素的研究进展作了综述     

重大禽病浓缩疫苗的研制

利用PALL滤器将灭活后的新城疫、禽流感、传染性支气管炎、产蛋下降综合征等病毒分别进行10倍浓缩,经检验合格后,分别按照一定比例将抗原浓缩液与灭菌的医用白油配比,经胶体磨制备成三联或四联油乳剂灭活疫苗,均通过了实验室的各项指标检测。经过在隔离器进行实验室安全和效力检验,以及田间试验证明,该疫苗安全有效,抗体水平高,维持时间长,能够保护鸡群抵抗新城疫、禽流感、传染性支气管炎等强毒的攻击。     

Immuno-PCR for one step detection of H5N1 avian influenza virus and Newcastle disease virus using magnetic gold particles as carriers

Detecting avian influenza virus (AIV) and Newcastle disease virus (NDV) at low concentrations from tracheal and cloacal swabs of avian influenza- and Newcastle disease-infected poultry was carried out using a highly sensitive immunological-polymerase chain reaction (immuno-PCR) method. Magnetic gold particles were pre-coated with a capture antibody, either a monoclonal anti-AIV/H5 or monoclonal anti-NDV/F and viruses serially diluted ten-fold from 10(2) to 10(-5)EID(50)/ml. A biotinylated detection antibody bound to the viral antigen was then linked via a streptavidin bridge to biotinylated reporter DNA. After extensive washing, reporter DNA was released by denaturation, transferred to PCR tubes, amplified, electrophoresed and visualized. An optimized immuno-PCR method was able to detect as little as 10(-4)EID(50)/ml AIV and NDV. To further evaluate the specificity and the clinical application of this IPCR assay for AIV H5N1 and NDV, the tracheal swab specimens, taken from chickens which were infected with H5N1/AIV, H9N2/AIV, H7N2/AIV, NDV, IBDV, IBV/H(120), were detected by IPCR. Our data demonstrated that this monoclonal antibody-based immuno-PCR method provides a platform capable of rapid screening of clinical samples for trace levels of AIV H5 and NDV in one step.     

禽肉产品中禽流感与新城疫多重PCR-DHPLC检测方法的建立

应用多重RT-PCR反应(mRT-PCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立禽产品中禽流感病毒和新城疫病毒的快速检测方法。以禽流感病毒NP基因和新城疫病毒F基因各设计1对引物,经优化单相RT-PCR(sRT-PCR)反应体系,建立多重RT-PCR(mRT-PCR)同时检测禽流感和新城疫,其PCR扩增产物经DHPLC技术进行快速检测分析后,检测极限分别达10-0.5ELD50/0.1mL和10-1.5ELD50/0.1mL。与普通凝胶电泳比较,敏感性高2个数量级。特异性试验表明,mRT-PCR-DHPLC仅检测到禽流感病毒与新城疫病毒,而对其他5种禽类病原体和SPF鸡胚尿囊液均未检测到阳性吸收峰。所建立的方法检测不同亚型禽流感病毒29株、不同来源及不同毒力的新城疫病毒16株,结果与实时荧光定量PCR检测结果完全一致;与病原分离法同时检测人工感染鸡的组织脏器,两种方法检测禽流感的符合率为94.4%(34/36),检测新城疫的符合率为95.4%(21/22)。病原分离法的检出率虽高于DHPLC方法,但经统计学分析两者差异不显著,两种方法同时对27份进口鸡胗样品与90份棉拭子样品进行检测,阴性符合率为100%,可适用于进出口禽肉产品的检测。