PCR鉴定沙门氏菌血清分型方法的建立与应用

为建立快速有效、经济适用的沙门氏菌血清型鉴定方法,利用Primer Plex软件设计畜禽中常见沙门氏菌的菌体(O)抗原和鞭毛抗原(H)的引物,优化引物比例和退火温度等反应条件,建立沙门氏菌血清型鉴定的PCR法,并对46株沙门氏菌分离株进行血清型鉴定,同时与传统玻片凝集法和美国CDC的液相芯片(Luminex-x MAP)法进行比较。优化后获得了O抗原中B、C1、D和E1群的多重PCR引物,以及鞭毛抗原H1相抗原基因(fli C)和H2相抗原基因(flj B)的2对引物;建立了一套基于沙门氏菌O和H抗原的多重PCR血清型鉴定法;PCR法和Luminex-x MAP法鉴定出7种沙门氏菌血清型,传统玻片凝集法鉴定出6种血清型;PCR法与传统玻片凝集法和Luminex-x MAP鉴定结果的符合率均为95.65%。本研究建立的PCR沙门氏菌血清型鉴定法简便、快速,预期可在沙门氏菌的血清分型研究中发挥作用。     

猪丹毒杆菌的血清学特性

近年来,不断发现猪丹毒杆菌新血清型菌株,对不同血清型菌株的致病性、诊断与免疫等,引起了研究者的重视。我国对丹毒杆菌血清型的研究,早在五十年代马闻天等以Dedie,k的方法,检查了从我国各省区搜集的丹毒杆菌107株,其中A型46、B型40、N型21株。以各型的代表株经琼扩沉淀反应检查结果,证明有不同的抗原构造,崔治中1979年报告在河北省馆陶县除分离到A、B、N型外,并有他命名的G_1,G_2及G_3型。1980—1982年中监所搜集到了国外现有的22个血清型的参考菌株,经分别制成了免疫血清,初步检查我国各地从急性病例分离的丹毒杆菌148株,结果1a型占81.0%,2型占18.2%,但从15头健康猪分离的菌株,除1a型和2型外,还有5、6、8、3、11及21型。而且出现有用同一菌株制的抗原对2或3个型血清有反应。据荣昌畜牧兽医学院佘永建等人用免疫血清作培养凝集试验,对1及2型均有凝集。R.L.Wood报告用1型茵制的菌苗,对9及10型免疫力低或无免疫力。为此,猪丹毒杆菌的血清型与流行病学和免疫的关系如何有待深入研究。为了有助于开展这方面的工作,我们将阐述较全面的1975年Howard.w.Dunne的《猪病学》第四版猪丹毒杆菌血清学特性一章全文译出,供参考。     

四川部分地区分离的猪丹毒菌株血清型鉴定及对流免疫电泳的应用

Dedie(1949)证实猪丹毒杆菌具有不同的血清型,命名为A型、B型及一个未能分型的N型。Heuner(1958)利用盐酸及醋酸浸出的菌体抗原进行沉淀反应,将Dedie的A型及B型进一步分为A_1、A_2及B_1、B_2四个型,同时还记述了C、D型。Murase等(1960)由健康猪扁桃体分离的猪丹毒     

猪丹毒杆菌血清型的研究

自Watts(1940)发现猪丹毒杆菌具有不同血清型以后,Dédié(1949)采用酸裂解透析法制取猪丹毒杆菌沉淀抗原,通过与相应抗血清做沉淀反应的结果,将猪丹毒杆菌分为A、B和N三个血清型。此后,Heuner(1958)采用盐酸浸出法和醋酸浸出法制备的沉淀抗原进行沉淀反应,又将A、B两型分为A_1、A_2和B_1、B_2四个亚型,还发现了C和D型,在Murase和Castro等人的报告中,提出C、D、E、F、I、J、K和N型。1964—     

用单克隆抗体进行副鸡嗜血杆菌定型

抗副鸡嗜血杆菌血清A和C型株所制备的两个血清型单克隆抗体（MAbs），分别对副鸡嗜血杆菌血清型A、B、C中的各型参考株作HI和dot－blotting试验。一种MAb（E5C12D10）为抗血清型A代表株221，另一种MAb（F2E6）为抗血清型C代表株S1。在两种试验中，不同血清型的MAbs可与对应的血清型中的副鸡嗜血杆菌株血凝（HA）抗原反应，而与血清型B代表株91、147均无反应。故这些MAbs可用于dot－blotting或HI试验进行副鸡嗜血杆菌定型。     

粘膜弯杆菌的血清型

把从猪增殖性肠炎(PE)分离的粘膜弯杆菌经福尔马林处理,将其菌体作抗原试行血清分型。制作了13株对照的免疫血清,通过加热处理的同型抗原及出现交叉凝集的菌株进行吸收。其结果是除历来报道的3种血清型A、B、C外,又确认了7种新血清型。用这10种抗血清鉴别从PE分离的717株粘膜弯杆菌的血清型时,A血清型596株,B血清型1株,C血清型14株,剩余106株属新的血清型。     

钩端螺旋体病

据报道,问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(波摩纳血清型、黄疸出血血清型、犬型血清型、哈勒焦血清型和布拉迪斯拉发血清型)、博氏钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii)(赛罗血清型和塔拉索夫血清型)以及Leptospira kirschneri(感冒伤寒型血清型)均可感染猪(图1,图2).     

我国禽源多杀性巴氏杆菌血清型研究

本试验用Carter的荚膜群鉴定法和Heddlesten的热稳定抗原鉴定法对我国116株禽源多杀性巴氏杆菌进行了血清学分型研究。研究表明,A∶1型是我国最主要的血清型,占69.8%,其次为A∶1(14)型和A∶3(4)型,分别占6.8%和4.3%。并对我国目前使用和试用的8株禽霍乱弱毒菌苗株进行了定型,其中3株为A∶1型,与主要血清型相同,5株与主要血清型不一致。在A∶1型菌株中,大部分菌株的耐热抗原与1型标准血清反应,形成1条沉淀线,部分菌株(9株)形成2条沉淀线,表明在A∶1型菌株中还存在有抗原差异。     

猪链球菌1型的分离与鉴定

猪链球菌是1987年新设立的一个种,按荚膜抗原的差异分为35个血清型,其中猪链球菌2型毒力最强,猪链球菌1型也是猪链球菌病的一种重要病原。目前对猪链球菌2型的研究很多,但对猪链球菌1型的研究甚少,试验对分离到的1株猪链球菌1型菌株进行了分子生物鉴定,现报道如下。1材料和方法     

鸭甲型肝炎病毒的遗传和抗原稳定性分析

本研究测定了实验室保存的25株(2000年～2017年)鸭甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)和32株(2008年～2017年)鸭甲型肝炎病毒3型(DHAV-3)的VP1基因序列,利用生物信息学软件对其以及Genbank中下载的DHAV的VP1基因进行遗传进化关系分析,并选取代表毒株进行血清中和试验,分析DHAV-1或DHAV-3的遗传和抗原稳定性。结果表明,DHAV-1进化为2个遗传分支,2016年～2017年的分离毒株分布在同一分支上;DHAV-3进化为2个不同的分支,2008年～2017年分离毒株集中在相同分支上,又进一步进化为不同的亚分支;DHAV-1或DHAV-3毒株之间无明显的地理分布差异。血清交叉中和试验结果表明,DHAV-1或DHAV-3同一血清型之间具有较好的交叉保护,表明同一血清型的DHAV未发生抗原变异。本研究揭示了DHAV-1或DHAV-3的遗传进化特点和相同血清型之间的抗原稳定性。     

鹿钩端螺旋体病的诊治

正鹿钩端螺旋体病是由致病性钩端螺旋体引起的一种急性或隐性感染的传染病。以短期发热、黄疸、血红蛋白尿、出血性素质、母鹿流产为特征。1病原体钩端螺旋体细长圆形,呈螺旋状,一端或两端弯曲呈钩状,能活泼运动。菌体不易被普通染料着色,用姬姆萨氏染色呈淡紫红色,用镀银染色呈棕黑色。钩端螺旋体的抗原构造比较复杂,迄今已发现有20个血清群,170余个血清型,我国发现包括49个血清型,并选定14个群的15个型作为我国     

牦牛源多杀性巴氏杆菌血清型鉴定及ompH基因序列分析

为分析牦牛多杀性巴氏杆菌(P.multocida)分离株与疫苗株的血清型和ompH基因差异,本研究利用PCR方法鉴定其血清型,并克隆、测序ompH全长基因,用DNAMAN、DNAStar对其进行生物信息学分析.结果显示,分离株与疫苗株血清型为B型,标准株血清型为E型.分离株和疫苗株ompH基因编码氨基酸有2个缺失和2个突变,同源性为99.4％.研究表明ompH基因具有很高的同源性,但氨基酸的缺失和突变可能使抗原表位发生变化,也是导致免疫失败的原因之一.     

猪钩端螺旋体病

<正>据报道,问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)(波摩纳血清型、黄疸出血血清型、犬型血清型、哈勒焦血清型和布拉迪斯拉发血清型)、博氏钩端螺旋体(Leptospira borgpetersenii)(赛罗血清型和塔拉索夫血清型)以及Leptospira kirschneri(感冒伤寒型血清型)均可感染猪(图1,图2)。波摩纳血清型和布拉迪斯拉发血清型只感染猪;其他血清型通常     

水禽源沙门菌的分离鉴定与PFGE分子分型

为了明确目前广东省水禽源沙门菌的优势血清型及其分子流行病学动态,采用细菌分离纯化、生化特性鉴定和PCR扩增从316份样品中分离鉴定出188株水禽源沙门菌;采用玻片凝集法将分离株分为4(B、D、C1、E1)个群别8种血清型;采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型法对分离株进行分子分型,得到PFGE-XbaⅠ带型62种,菌株间相似度为54.1%~100.0%,分为A^I共9个聚类簇与11个单一基因型。结果表明,广东水禽源沙门菌优势血清型为鼠伤寒沙门菌,PFGE-XbaⅠ带型具多样化,其中11种PFGE-XbaⅠ带型在区域和年份小范围集中流行,32种带型跨区域与跨时间交叉分布呈散在"流行暴发",不同血清型分离株的PFGE-XbaⅠ带型差异较大,相同血清型的分离株PFGE-XbaⅠ带型一般具有相同图谱型或聚类在一起。本研究采用PFGE法进行分子分型分析具有流行病学意义,并探明了本地沙门菌分离株血清型与分子分型的关系。     

水牛在马来西亚钩端螺旋体传染之流行病学中的作用

从马来西亚的三群印度水牛(Bubalus bu-balis)所采集的血清样品中,有30%(28/95)的抗体与一个或更多个钩端螺旋体抗原起凝集反应。最常见的反应是对血清型为:tarassovi 的(占15.8%)、hardjo 的(占14.7%)和 Pyroge-nes (占12.6%)的钩端螺旋体。将这三群水牛的管理方法进行了比较,其中只有一群水牛有钩端螺旋体传染的高度流行(占被检牛的64%)。从这个调查中可看出,水牛在马来西亚钩端螺旋体传染之流行病学中并不起主要作用。     

水貂绿脓杆菌(山东株)血清分型和ERIC-PCR分型的研究

为了探明水貂出血性肺炎病原和流行特点,2011-2012年对山东省15个水貂养殖场进行水貂出血性肺炎流行病学调查。从病貂中分离出19株绿脓杆菌,分别测定了分离株的血清型,同时应用肠杆菌科基因间重复序列聚合酶链反应(ERIC-PCR)对菌株进行DNA分型。结果 19株分离株中血清型G型15株,血清型B型2株,血清型E型和I型各1株;ERIC-PCR谱型表现为7种基因型,其中15株G型株存在于谱型Ⅰ~Ⅶ中(Ⅵ除外),B型株属于谱型Ⅱ,I型株属于谱型Ⅳ,E型株属于谱型Ⅵ。表明山东地区水貂出血性肺炎由绿脓杆菌引起,其分离株血清型以G型为主,基因型呈现多样性。     

河北馆陶县猪丹毒杆菌的血清型调查报告

关于猪丹毒杆菌的血清型研究,国外已积累了不少资料,至今已发现有十六个血清型。但是,国内除A、B型外,对猪丹毒杆菌的其它血清型还很少有报导。笔者从1975年到1977年,在河北省馆陶县检查了猪丹毒杆菌的血清型分布,从败血型猪丹毒病猪分离到十株猪丹毒杆菌,1976年7月——1978年9月,在206头临床表现健康的屠宰肥猪中,有50头猪(24.3％)从扁桃体分离到猪丹毒杆菌。根据菌体上的酸溶性抗元,应用琼脂扩散沉淀反应鉴定了它们的抗原结构。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌参考株抗血清的制备及野毒株血清型鉴定

将猪传染性胸膜肺炎放线杆菌全部12个血清型的国际参考菌株接种于培养基大量培养。回收菌体、甲醛灭活后，加入蜂胶佐剂制成疫苗。分别免疫健康的试验用白兔。获得针对该菌单一血清型的抗血清。虽然不同血清型间有一定的交叉反应，但对同源菌株的菌体抗原的凝集效价最高。分别可达6～8个log2。用该套血清对2003年从山东省各地分离到的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌野毒株11株进行了血清型鉴定。分别为3型（2株）、4型（1株）、5型（4株）和7型（4株）。     

两株羊溶血性曼氏杆菌的分离及其生物学特性研究

为了分离新型曼氏杆菌并研究其生物学特性,试验对从两例山羊病例中分离出的相似细菌进行纯化培养,通过革兰氏染色镜检、生化试验、16S rDNA基因序列测定、多位点序列分型法(MLST)鉴定、血清型鉴定、药敏试验等方法研究其生物学特性。结果表明:分离得到2株革兰氏阴性菌,2株细菌的生化试验和16S rDNA基因序列分析鉴定符合溶血性曼氏杆菌的特点,将其分别命名为201705YF和201805YS;对2株细菌进行血清型1型、2型和6型的多重PCR鉴定,201705YF为血清型2型,而201805YS的1型、2型和6型血清型检测为阴性;对2株细菌的7个管家基因adk、aroE、deoD、gapDH、gnd、mdh和zwf进行扩增并测序,菌株201705YF对应的7个管家基因的序列号为50,20,15,19,15,17,19,菌株201805YS对应的7个管家基因的序列号为1,2,20,2,1,1,1,这2株细菌的基因型为新基因型,即ST50和ST51;2株细菌对左氧氟沙星、卡那霉素、多黏菌素B、氟苯尼考、诺氟沙星、多西环素、美洛西林、环丙沙星、头孢哌酮等抗生素敏感,但201705YF对丁胺卡那耐药,201805YS对庆大霉素、新霉素、妥布霉素耐药。说明从送检病死山羊中分离出的2株细菌为不同血清型和新ST型的溶血性曼氏杆菌,为溶血性曼氏杆菌进化和流行病学关系研究提供了新的相关研究数据。     

副猪嗜血杆菌多价平板凝集抗原的研制

为了建立副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)平板凝集抗体检测方法,试验采用方阵试验方法对15种HPS菌体抗原和阳性血清的交叉凝集反应性进行了研究,从中筛选出能与所有血清型HPS血清发生凝集反应的多价抗原,并测定其特异性。结果表明:各血清型HPS抗原抗体之间均存在不同程度的交叉凝集反应,但没有任何一种血清型的HPS能与全部15种血清型抗体发生凝集反应,由各血清型的交叉凝集谱可见,血清1型、6型、7型等三个血清型抗原能覆盖全部15个血清型抗体,据此选择这三个菌株作为多价抗原生产菌株。将其接种于含NAD的TSA平板上,于37℃培养18 h,用pH值为7.2的PBS洗下菌苔并将菌液浓度分别调整至8×10~9cfu/m L,三种菌液用甲醛灭活后等体积混合即为HPS平板凝集多价凝集原,其能与15个血清型HPS抗体发生75%及以上的凝集反应,能凝集HPS的感染抗体和免疫抗体,不与猪传染性胸膜肺炎等被检的无关疫病的阳性血清发生反应。说明试验制备的多价平板凝集抗原能用于HPS抗体的检测和血清流行病学调查。