菌丝霉素NZ2114毕赤酵母工程菌高效发酵工艺的研究

抗菌肽是饲料中广泛使用的药物抗生素的有效替代品之一。菌丝霉素作为一种革兰氏阳性菌抗菌肽,其活性研究已积累较多数据,但发酵工艺摸索还少见报道。重组菌丝霉素酵母工程菌的高效表达是后续能否进行大规模生产的瓶颈之一。本文通过培养基配方,接种条件,甲醇诱导和流加方式,菌体湿重几个方面入手,探讨了对重组菌丝霉素蛋白表达量影响的主要因素,得出使用BSM培养基,接种量为15%,甲醇诱导48小时,湿重达到300g/L时,菌丝霉素的表达量最高,活性最佳,同时经济成本也可得到相应控制。本研究为后续重组菌丝霉素的生产提供了理论和试验数据支撑。     

抗菌肽酵母制剂的生产及其作饲料添加剂应用价值的探讨

1 蚕抗菌肽酵母制剂的生产与作饲料添加剂的应用效果 1.1 蚕抗菌肽AD的发酵生产我们以50L发酵罐培养Cecropin AD工程酵母,在优化发酵条件后,用甲醇诱导启动醇氧化酶启动子而成功表达抗菌肽AD基因并分泌杂合抗菌肽AD到菌体外,     

植酸酶的高密度发酵、制备及其应用研究

从甲醇添加量、诱导温度、生长时间等方面对重组酵母摇瓶发酵条件进行研究,并以此为基础探讨其在30L发酵罐上产植酸酶的条件,从而为大规模的生产提供理论依据。对发酵过程中的诱导时间,诱导期间的甲醇与甘油的流加速度和比例以及诱导pH值进行了分析。得到最佳产酶条件为生长时间20h、甲醇流加速度5ml/(L·h)、诱导期甘油流速速度1ml/(L·h)、诱导pH值为4、诱导时间84h、诱导温度26℃,酶活力可达到454U/ml,比未优化前提高接近3倍。发酵液经过超滤浓缩添加复合稳定剂制成饲料后投入到小规模草鱼养殖应用中,结果表明,在植酸酶添加量为0.08%可以替代磷酸二氢钙,证明该菌株具有大规模工业化生产的前景。     

植酸酶的高密度发酵、制备及共应用研究

从甲醇添加量、诱导温度、生长时间等方面对重组酵母摇瓶发酵条件进行研究,并以此为基础探讨其在30 L发酵罐上产植酸酶的条件,从而为大规模的生产提供理论依据.对发酵过程中的诱导时间,诱导期间的甲醇与甘油的流加速度和比例以及诱导pH值进行了分析.得到最佳产酶条件为生长时间20 h、甲醇流加速度5 ml/(L·h)、诱导期甘油流速速度1 ml/(L·h)、诱导pH值为4、诱导时间84 h、诱导温度26℃,酶活力可达到454 U/ml,比未优化前提高接近3倍.发酵液经过超滤浓缩添加复合稳定剂制成饲料后投入到小规模草鱼养殖应用中,结果表明,在植酸酶添加量为0.08%可以替代磷酸二氢钙,证明该菌株具有大规模工业化生产的前景.     

工程菌产植酸酶摇瓶发酵条件初探

本实验根据毕赤酵母工程菌的特点,在摇瓶中对重组毕赤酵母工程菌株PP-MS-NPm-4-16的发酵条件进行初步研究。确定了60%麦芽-麸皮培养基,40%的蚕蛹培养和190mg/L的酵母营养盐作为高密度发酵的基础培养基,生长阶段和诱导阶段最佳pH分别为5.0和5.5。通过正交实验得到工程菌的最佳摇瓶培养条件为:接种量4%,甲醇浓度40g/L,生长阶段豆油浓度1.3%,诱导阶段豆油浓度3.5%,植酸酶酶活最高可达到192400U/mL。     

菌丝霉素抑菌活性鉴定及其在防治牛乳腺炎中的应用

试验目的是通过毕赤酵母系统高效表达一种新的真菌防御素菌丝霉素,鉴定它的抑菌活性,并考察其对牛乳腺炎疾病的防治功能。将菌丝霉素基因克隆到酵母表达载体p Pic Zα中,转化并重组到毕赤酵母GS115中。经过甲醇诱导表达,分离纯化,进行体外抑菌活性鉴定。结果显示菌丝霉素在1μg/ml浓度下,对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等起到抑制作用,对耐药性金黄色葡萄球菌的MIC为10~50μg/ml。鉴于上述细菌是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌,我们将0.05%菌丝霉素蛋白灌注到奶牛乳腺中,经过7 d的治疗期,发现奶牛乳腺炎得到有效治疗或缓解。上述结果表明菌丝霉素在0.05%剂量下,对奶牛乳腺炎具有防治作用,可望开发为一种新兽药。     

菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达及中试发酵研究

构建表达菌丝霉素NZ2114蛋白的真核重组表达质粒p Pic Zα-NZ2114,并转化毕赤酵母菌GS115,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得菌丝霉素NZ2114组成型表达菌株,并采用p H-溶氧监控策略进行工程菌毕赤酵母菌GS-115/p Pic Zα-NZ2114的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母GS115中的组成型表达p Pic Zα-NZ2114,Tricine-SDS-PAGE分析显示,在4.4 k Da处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐诱导培养96 h后取上清,对金黄色葡萄球菌CMCC26003有明显的抑制作用。菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达的方法在本研究中成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白毕赤酵母分泌表达及发酵条件优化

为实现猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白在酵母中的高效表达,本研究将去除信号肽并经序列优化后的PCV2 ORF2片段插入pPICZαA表达载体,将重组表达质粒克隆转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33感受态细胞中,应用Zeocin抗性和PCR法对转化子进行初步筛选和表型鉴定,利用"双膜法"筛选出PCV2 Cap表达量相对较高的酵母。采用正交试验对优选的酵母进行发酵试验,分析培养基pH、甲醇诱导时间、甲醇诱导浓度和诱导时酵母浓度对PCV2重组Cap蛋白(rCap)分泌表达的影响。结果显示酵母分泌表达PCV2 rCap的优化条件为:培养基pH为5.0,发酵液OD600nm至1.0,加入终浓度1.0%甲醇诱导96 h。优化后的PCV2 rCap分泌量可达207.58μg/m L。中和试验结果显示,发酵产物PCV2 rCap免疫小鼠产生的抗体可有效中和PCV2。本研究为利用酵母表达PCV2 Cap进行疫苗研制奠定了基础。     

基于发酵饲料与微生态制剂的无抗方案与应用实例

正1无抗之路如何走?今后的无抗是以生物技术为主线的多元化道路,以发酵或酶处理提高饲料消化为前提的多重生物防护方案。具体的讲,主要是通过发酵饲料的应用,再加上微生态制剂、酶制剂等共同构成无抗饲料的核心。通过综合利用这些技术,达到无抗养殖的效果。2无抗饲料解决方案无抗饲料的解决方案是将生物饲料之间进行组合的应用,包括蛋白质发酵饲料、乳酸菌发酵培养物、酵母培养饲料、有机矿物饲料(钙)、复合微生态饲料、复合酶制剂等。     

不同干燥方式对蓝莓果粉品质的影响

本文分别采用真空冷冻干燥、远红外干燥、热风干燥、真空微波干燥、喷雾干燥5种干燥方式制备蓝莓果粉,研究不同干燥方式对果粉的物理特性、基本营养成分和颗粒结构的影响。试验结果表明：真空冷冻干燥和喷雾干燥的蓝莓果粉容重较低,分别为0.248 g/mL和0.420 g/mL,润湿下沉时间和分散时间较短,分别为37.67s 和 23.77s、1s和1s,水合能力较高,分别为8.54g/g和10.74g/g,游离氨基酸含量较高;扫描电镜图片显示真空冷冻干燥的蓝莓果粉颗粒薄片状,喷雾干燥的蓝莓果粉颗粒球形,空隙适中。综上认为,真空冷冻干燥和喷雾干燥的蓝莓果粉品质较优,能够最大限度的保留营养成分,这对实现蓝莓果粉工业化生产选择合适干燥方式能够提供一定的理论依据。     

酵母多糖对乳酸菌发酵特性的影响

采用体外发酵法,研究了0.2%、0.5%和0.8%酵母多糖对乳酸菌EA-1发酵液pH值及乳酸和SOD产生的影响。结果表明,发酵前期(48h以前)各处理组发酵液的pH值高于对照组,而乳酸和SOD浓度低于对照组,提示发酵前期酵母多糖对乳酸菌的乳酸和SOD产生能力具有一定的抑制作用。发酵后期(72h之后),各处理组pH值均低于对照组,其中发酵96h和120h时,0.5%和0.8%酵母多糖处理组pH值均显著低于对照组(P<0.05)。发酵96h后各处理组乳酸浓度均显著高于对照组(P<0.05),提示发酵后期酵母多糖能促进乳酸菌的发酵产生乳酸。发酵96h,0.2%和0.5%处理组SOD浓度显著高于对照组(P<0.05),发酵120h各处理组SOD浓度显著高于对照组(P<0.05),提示发酵后期酵母多糖能促进乳酸菌产生SOD。     

体外研究反刍兽新月形单胞菌及与酵母联用对瘤胃微生物发酵的影响

利用体外批次培养技术,分别以羊草、玉米和淀粉为底物,研究了反刍兽新月形单胞菌L9菌株及其与酵母联用对瘤胃微生物发酵的影响。结果显示,以羊草为底物时,添加酵母可显著提高乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度(P<0.05),有降低乙丙比值的趋势(P=0.082),但对异丁酸及pH值无显著影响(P>0.10),添加L9菌可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),但对异丁酸及戊酸浓度无显著影响(P>0.10),在影响pH值、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比值方面,酵母与L9菌株间无显著的互作关系(P>0.10);在降低乳酸及戊酸浓度方面,酵母与L9菌株之间有显著的互作作用(P<0.05),在影响pH值及乙酸产量方面,酵母与L9菌之间有互作效应趋势。以玉米为底物时,添加酵母可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),有提高戊酸浓度的趋势(P=0.082),但对异丁酸无显著影响(P>0.10),添加L9菌可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),但对异丁酸浓度无显著影响(P>0.10),在影响pH值、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比值方面,酵母与L9菌株间有显著的互作关系(P<0.05);在影响异丁酸及戊酸浓度方面,酵母与L9菌株之间无显著的互作作用(P>0.10)。以淀粉为底物时,添加酵母可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度(P<0.05),但对戊酸、异丁酸浓度和乙丙比值无显著影响(P>0.10),添加L9菌可显著提高pH值、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和TVFA浓度(P<0.05),降低乳酸浓度和乙丙比值(P<0.05),但对异丁酸和异戊酸浓度无显著影响(P>0.10),在影响pH值、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、TVFA浓度及乙丙比值方面,酵母与L9菌株间有显著的互作关系(P<0.05);在影响异丁酸及戊酸浓度方面,酵母与L9菌株之间无显著的互作作用(P>0.10)。结果说明,添加酵母与L9菌株均可有效降低乳酸产量,且均可有效提高玉米及淀粉条件下发酵体系中的pH值,酵母与L9菌株联用更有助于发酵前期pH值的稳定。     

枯草芽孢杆菌饲料制剂喷雾干燥制备及稳定性研究

本文研究枯草芽孢杆菌饲料制剂的喷雾干燥制备及其存储与应用过程中菌体稳定性。通过对喷雾干燥工艺、喷雾干燥保护剂的研究,获得枯草芽孢杆菌饲料制剂的喷雾干燥制备条件。在喷雾干燥出风温度为70℃时,枯草芽孢杆菌活率较高;以脱脂乳作为喷雾干燥保护剂,对菌体的保护效果要显著优于其他保护剂。通过存储实验,表明随着温度的升高,枯草芽孢杆菌制剂的活力下降,在-20℃和4℃条件下存储4周,菌数基本维持稳定,但25℃环境下活菌数下降较快。通过研究饲料载体对枯草芽孢杆菌制剂活性的影响,表明不同载体对制剂活性影响不显著,而饲料的水分含量对制剂的活性具有显著的影响。本研究将为枯草芽孢杆菌在饲料工业中的应用提供参考。     

猪α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达和下游工艺的研究

通过小量发酵、摇瓶发酵、大量发酵,研究猪α-IFN在毕赤酵母中表达的下游工艺,微量细胞板法测猪α-IFN体外抗VSV、PRRSV、TGEV的活性.猪α-IFN抗VSV的活性达到4.04×10~6IU/L,在PK15上抗TGEV的活性为10~7～10~8IU/L,在Mare 145上抗PRRSV的活性为10~6～10~7lU/L.30℃诱导培养96 h、甲醇添加1%、pH值6.0、DO 20%、0.25%～0.4%甲醛灭活,获得高活性的、安全的IFN.仔猪免疫后临床症状正常,未出现病理学变化.猪α-IFN体外抗病毒活性高,发酵后的抗病毒活性未下降,免疫动物未产生临床症状和病理变化,可用于临床治疗病毒性疾病.     

马阴道微生态制剂的制备工艺研究

[目的] 确定利用马源乳酸菌制备阴道微生态制剂的制备工艺参数。[方法] 以分离自蒙古马阴道的格氏乳杆菌作为制备微生态制剂的菌株,利用发酵学技术及响应面法,对菌株的发酵培养基、工艺参数及制剂的配方和工艺参数进行优化。[结果] 乳糖和大豆胨对菌粉的生长性能影响较大,工艺参数中发酵液初始pH值为6.6,温度为40 ℃,菌种接种量为6%时,对菌粉的发酵性能影响较大。而后利用药物制备学技术及响应面法,对制剂的配方及工艺参数进行了优化,结果显示,菌粉与淀粉、微粉硅胶、微晶纤维素混合比例167.05∶1.61∶1,多功能药用机转速为20 r/min,角度为60°时所制备制剂的活菌数较其他工艺条件下高。[结论] 确定了利用马源格氏乳杆菌制备阴道微生态制剂的关键工艺参数,为进一步探索应用活菌制备的微生态制剂预防和治疗马阴道感染提供参考。     

东北林蛙皮肤抗菌肽基因在毕赤酵母中表达条件的优化

目的:确定毕赤酵母表达东北林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-1ST基因的最佳诱导表达条件。方法:本研究将PCR合成的dybowskin-1ST基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建pPIC9K-dybowskin-1ST诱导型表达载体。表达载体经线性化后转化巴斯德毕赤酵母GS115,应用BMMY培养基诱导表达。采用单一变量法及正交试验法,对甲醇诱导的浓度、时间和温度进行了优化,通过SDS-PAGE电泳分析和体外抑菌试验检测目的肽表达丰度。结果:最佳诱导条件:甲醇终浓度为0.5%、诱导时间为72 h、诱导温度为28℃,在此条件下表达产物SDS-PAGE电泳条带灰度值为117,抑菌环直径为28.16mm,可为规模化的抗菌肽表达提供参考数据。     

饲用产朊假丝酵母的发酵培养条件研究

产朊假丝酵母(Candida utilis)是优良的饲料蛋白,在发酵饲料生产中得到广泛应用。利用单因素比较试验和响应面分析方法,对产朊假丝酵母的发酵培养条件进行了优化,获得了二次回归模型,建立起产朊假丝酵母的最优发酵培养条件:葡萄糖19.86 g/l、酵母膏9.56 g/l、K2HPO41.45 g/l、MgSO41.12 g/l,pH值5.5,发酵温度28℃。试验结果表明,该菌株具有生产速度快、易于培养的特点。     

醇氧化酶aox1基因缺失对毕赤酵母菌产植酸酶的影响

研究通过同源重组的方法,敲除产植酸酶毕赤酵母菌株的醇氧化酶aox1基因,以改变菌株利用甲醇的速度,降低甲醇用量。试验得到一株甲醇利用慢型毕赤酵母,能降低发酵成本。在实际发酵生产中,aox1基因缺失的菌株发酵能力与原有菌株接近,生产能耗大幅降低,甲醇用量降低,最终单罐发酵成本降低约20%～24%。     

酸奶生产用直投式乳酸菌发酵剂研究

对酸奶常用发酵剂菌种德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1、嗜热链球菌G1208的高密度细胞培养条件,低温真空冷冻干燥中抗冷冻保护剂的选择等进行了研究。结果发现,德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌亚种S-1在改良MRS培养基中的最佳培养条件为:培养温度43℃,起始pH值6.0,最高活菌数为1.2×109cfu/mL;采用3%蔗糖+3%海藻糖+10%β-环糊精+10%甘油+1%酵母膏+10%脱脂奶作为冻干保护剂,经低温冷冻干燥后,存活率为40.8%。嗜热链球菌G1208的最佳培养条件为:培养温度37℃,起始pH值7.0,对培养基配方进行优化后,最高活菌数为1.7×109cfu/mL;采用3%海藻糖+1%酵母膏+10%脱脂奶作为保护剂经低温冷冻干燥后,存活率可达96%。     

毕赤酵母基因工程菌产植酸酶发酵条件的研究

该试验对毕赤酵母基因工程菌产植酸酶的发酵条件作了初步的研究，分别对接菌量、接菌种龄、诱导发酵pH及甲醇添加量进行了研究与分析。