‘合作猪’TDRP1基因的克隆及生物信息学分析

【目的】丰富猪TDRP1基因研究的基础数据.【方法】以猪NM_001198925序列为参考,设计特异性引物,通过克隆测序获得‘合作猪’TDRP1基因完整CDS序列,并进行生物信息学分析,同时采用实时荧光定量PCR方法检测TDRP1基因在不同组织中的表达特性.【结果】获得了TDRP1基因完整的CDS序列(GenBank登录号:KU743254),共684bp,其编码186个氨基酸多肽.与参考序列相比,在编码区第33、348位点处发生了同义突变(C→G、C→T).TDRP1基因分子式为C_(897)H_(1421)N_(259)O_(287)S_2,理论等电点(PI)为5.86,不稳定系数为62.66,疏水指数为64.03,平均亲水性为-0.939,属不稳定可溶性酸性蛋白质.二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主,属混合类蛋白质.亚细胞定位结果显示,TDRP1编码的蛋白质在遗传物质复制和转录、翻译过程中发挥功能的可能性分别为26.3%、14.3%,明显高于发挥其它功能的可能性.mRNA表达分析表明,TDRP1基因在垂体和睾丸中高表达,肺、肾、小脑、卵巢中度表达,肝、脾、大脑、胃、小肠中低表达,心脏组织中不表达.【结论】成功克隆了‘合作猪’TDRP1基因的完整CDS区序列,并发现了2个SNP位点;多组织转录表达分析表明TDRP1在垂体和睾丸中表达较高,可为深入研究TDRP1基因的功能提供参考.     

缺氧诱导因子-1α蛋白在犬乳腺肿瘤中的表达及其临床意义

【目的】为了探明缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在犬乳腺肿瘤中的表达情况。【方法】采用病理组织学方法对从宠物临床收集的20例疑似犬乳腺肿瘤的样本进行肿瘤性质的鉴定,利用免疫组织化学技术检测犬乳腺肿瘤中HIF-1α的差异表达。【结果】在不同犬乳腺肿瘤组织中均能检测到HIF-1α的表达,其阳性部位主要分布于肿瘤细胞的胞浆和胞核中,呈现典型的黄色或黄褐色的特异着色。HIF-1α在恶性犬乳腺肿瘤组织中的表达显著高于良性组织(P0.05),阳性表达率为85.7%。【结论】HIF-1α在肿瘤恶性变中起着重要的作用,对肿瘤诊断和预后评价有重要的参考意义。     

黄牛、牦牛和犏牛b-Sycp2基因的克隆 与睾丸组织mRNA的表达水平

【目的】克隆黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,了解牛Sycp2基因序列特征和组织表达特征,分析睾丸组织中Sycp2基因的表达水平。【方法】采用电子克隆和克隆测序技术获得黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因序列,利用生物信息学方法分析其序列特征;采用RT-PCR分析牛Sycp2基因的组织表达特征;采用real-time PCR技术检测黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织Sycp2基因的表达水平。【结果】①黄牛、牦牛和犏牛Sycp2基因编码区序列全长均为4 365 bp,命名为b-Sycp2,编码蛋白含有1 454个氨基酸残基,并包含卷曲螺旋结构域等典型结构域;②b-Sycp2基因在睾丸组织中特异表达,黄牛和牦牛睾丸组织中b-Sycp2基因的表达水平显著高于犏牛（P＜0.05）。【结论】成功克隆了b-Sycp2基因,b-Sycp2基因为睾丸组织的特异表达基因,且黄牛和牦牛睾丸组织b-Sycp2基因表达水平显著高于犏牛。     

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为：睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。     

版纳微型猪近交系KITLG基因克隆、组织表达及功能特性分析

【目的】研究KITLG基因在猪生殖细胞发育过程中的作用。【方法】从Gen Bank下载猪KITLG序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)附睾组织中扩增KITLG基因完全编码序列及部分侧翼序列;应用半定量PCR技术检测BMI 10个重要组织的KITLG m RNA转录表达水平,并对KITLG翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析,预测KITLG蛋白质的功能,最后构建KITLG的多物种氨基酸系统进化树。【结果】扩增得到BMI KITLG编码区序列长825 bp,编码274个氨基酸,序列已提交Gen Bank,基因登录号KU705624,对应的氨基酸登录号AOC89042。多组织相对半定量表达分析表明:KITLG基因在附睾、心、脾、肺、肾、胃中高表达,在大脑、肝、小肠和睾丸中低表达。功能生物信息学分析表明:KITLG存在1个保守结构域SCF,有1个跨膜螺旋结构,存在N端信号肽序列,N末端和C末端均亲水,二级结构以α螺旋为主,有5类功能活性位点。系统进化分析表明:KITLG在进化中高度保守,且与牛、羊的亲缘关系最近。【结论】研究结果为探索BMI KITLG基因在生殖细胞发育过程中的作用及功能奠定基础。     

小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶的影响

【目的】探讨小花棘豆中毒对家兔丘脑-垂体-性腺轴α-甘露糖苷酶(AMA)的影响,揭示小花棘豆的毒性作用机理。【方法】将24只家兔随机分为对照组和试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,对照组饲喂青干草,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂添加15%,30%和45%小花棘豆全草的混合饲料(其苦马豆素含量分别为30,60和90mg/kg),分别于攻毒后第14,35和70天时每组随机采集2只家兔的丘脑、垂体和性腺,检测AMA在家兔丘脑-垂体-性腺轴中的分布、活性及其基因mRNA的表达量。【结果】AMA在家兔丘脑、垂体和性腺中均有分布,小花棘豆中毒可导致家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA活性和分布明显下降。试验组及对照组家兔丘脑-垂体-性腺轴高尔基体α-甘露糖苷酶Ⅱ(AMA1)和溶酶体α-甘露糖苷酶(AMA2)均有表达,但各试验组表达转录水平总体低于对照组,攻毒第70天时试验Ⅰ组家兔丘脑-垂体-性腺轴的AMA1和AMA2,试验Ⅱ组家兔丘脑-垂体-性腺轴及试验Ⅲ组家兔丘脑和垂体中AMA2的表达均与对照组差异不显著(P0.05);试验Ⅲ组家兔丘脑-垂体-性腺轴和试验Ⅱ组家兔丘脑、垂体、睾丸中AMA1mRNA表达量均极显著低于对照组(P0.01),试验Ⅱ组卵巢AMA1mRNA表达量显著低于对照组(P0.05),试验Ⅲ组家兔睾丸和卵巢AMA2mRNA表达量显著低于对照组(P0.05)。【结论】小花棘豆中毒可影响家兔丘脑-垂体-性腺轴AMA的活性及其基因的转录表达。     

1—2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA转录水平的相对定量研究

【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。     

犏牛及其亲本睾丸组织中印记基因SNRPN DMR甲基化与mRNA表达差异研究

【目的】研究犏牛与黄牛、牦牛睾丸组织SNRPN基因DMR甲基化状态、mRNA表达水平的差异,为揭示犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】根据黄牛SNRPN基因序列设计引物,通过克隆测序获得牦牛SNRPN基因5'端序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测犏牛及其亲本睾丸组织中SNRPN基因5'端DMR的甲基化状态,并采用Real-time PCR检测犏牛及其亲本睾丸组织中SNRPN基因的表达水平。【结果】牦牛SNRPN基因5'端序列长为1137bp,与黄牛的同源性达98.2%;生物信息学分析发现含有YY1和SP1等甲基化敏感位点。犏牛SNRPN基因DMR的甲基化水平(42.22%)极显著高于黄牛(21.08%)和牦牛(20.81%)(P0.01)。黄牛和牦牛睾丸组织中SNRPN基因mRNA表达水平高于犏牛,但未达到显著水平(P0.05)。【结论】犏牛睾丸组织SNRPN基因DMR的甲基化水平极显著高于黄牛和牦牛,且mRNA表达水平低于黄牛和牦牛,说明犏牛SNRPN基因可能是通过DMR区的高甲基化抑制其mRNA表达来阻滞精子发生减数分裂过程。     

家蚕GSK3α氨基酸序列分析及其mRNA转录水平研究

【目的】对家蚕(Bombyx mori)糖原合成酶激酶3α(GSK3α)蛋白的氨基酸序列进行分析,并检测家蚕不同发育时期及蜕皮激素、饥饿处理下,GSK3α基因mRNA转录水平的变化。【方法】以家蚕为供试材料,采用RTPCR和荧光定量PCR方法,研究家蚕GSK3α在不同发育期的表达和转录情况,及激素和饥饿处理对其转录的影响。【结果】家蚕GSK3α基因由2个外显子和1个内含子构成,其中内含子长度为1 411 bp,预测家蚕GSK3α蛋白质分子质量为33.78 ku,等电点为7.61。氨基酸系统进化树和序列多重联配分析结果表明,家蚕GSK3α与所选几种昆虫GSK3α的序列一致性较高(79%～91%)。家蚕GSK3α mRNA在幼虫取食期转录水平较高,在蜕皮期转录水平较低。在注射后6 h内,蜕皮激素对家蚕GSK3α基因mRNA的转录无诱导作用,但在注射12～24 h有较强的诱导作用,而且在注射12 h时诱导活性达到最高,之后逐渐降低。饥饿处理对家蚕GSK3α mRNA的转录水平影响较小。【结论】家蚕GSK3α在昆虫的进化过程中是比较保守的,其表达受到蜕皮激素的调控,饥饿处理对其转录水平影响较小。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

瘦素及其受体在真孕和假孕母犬下丘脑-垂体-性腺轴各组织中的表达

【目的】研究胚胎着床期瘦素(leptin)及其受体(OB-R)在真孕和假孕母犬下丘脑-垂体-性腺轴各组织中的表达差异.【方法】应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学的方法检测胚胎着床期真孕和假孕母犬下丘脑、垂体、卵巢、输卵管、子宫组织中瘦素及其受体的表达.【结果】瘦素在真孕和假孕母犬的下丘脑、垂体、卵巢、子宫中均有表达,在输卵管中表达阴性,瘦素受体在真孕和假孕母犬各组织中均有表达;瘦素及其受体在真孕母犬下丘脑、卵巢和子宫组织中的表达量显著高于假孕母犬(P0.05),瘦素受体在真孕母犬垂体和输卵管中的表达量显著高于假孕母犬(P0.05).真假孕母犬垂体中瘦素水平差异不显著(P0.05).【结论】瘦素及其受体对于犬的胚胎着床具有一定调节作用.     

铁皮石斛粗多糖预防化疗性肠道黏膜炎作用的研究

【目的】探究铁皮石斛粗多糖对5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导引起的小鼠化疗性肠道黏膜炎(CIM)的预防作用。【方法】健康雄性昆明鼠40只,随机分为正常组、CIM模型组(腹腔注射5-FU 130 mg/kg)及铁皮石斛粗多糖低、中、高剂量组(分别灌胃铁皮石斛粗多糖50、100和200 mg/kg,每日1次,持续2周,24 h后腹腔注射5-FU 130 mg/kg,每日1次,持续2 d),观察小鼠体质量变化情况,在腹腔注射5-FU 48 h后处死动物,对小肠进行形态学评价,检测小肠增殖细胞核抗原(PCNA)表达,对小肠屏障闭锁小带蛋白1 (ZO-1)、闭锁蛋白(Occludin)、炎症因子白介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达量进行检测。【结果】与CIM模型组相比,铁皮石斛粗多糖中剂量(100 mg/kg)组小鼠体质量明显降低;可增加小肠绒毛长度、降低隐窝深度、增加绒毛长度与隐窝深度比值;小肠PCNA表达量明显增加;可提高小肠屏障ZO-1和Occludin mRNA表达量;抑制炎症因子IL-1β和TNF-αmRNA表达量。【结论】铁皮石斛粗多糖具有预防5-FU引起的化疗性肠道黏膜炎。     

神经激肽B在犬生殖轴上的表达

【目的】研究神经激肽B(NKB)在犬生殖轴上的表达规律。【方法】以仔犬期、幼犬期、初情期母犬及成年公犬、母犬为研究对象,颈动脉放血处死后取其下丘脑、垂体、睾丸和卵巢,其中成年公、母犬的样本进行NKB免疫组化试验,观察NKB分布情况并拍照;仔犬期、幼犬期、初情期和成年期母犬样本进行RT-qPCR试验,以GAPDH为内参,测定样本中目的基因Tac3 mRNA的表达量。【结果】NKB主要分布于下丘脑外侧区和视上核、腺垂体、卵巢卵泡颗粒层细胞和卵母细胞及睾丸的间质组织和生精细胞,而神经垂体中未见分布。在母犬下丘脑、垂体和卵巢中,Tac3 mRNA表达量均表现为从仔犬期至初情期逐渐上升,于初情期达最高水平,至成年期又有所下降,且与其他各发育阶段差异显著(P0.05)。【结论】NKB可能参与母犬初情期的启动。     

加味四君子汤对犬消化吸收功能及小肠EGF、SS表达的影响

【目的】探究加味四君子汤对犬消化吸收功能及小肠EGF、SS表达的影响.【方法】选择1岁龄的比格犬18只,随机分为3组,每组6只,分别为A组(对照组)、B组(1%加味四君子汤组)、C组(2%加味四君子汤组).A组犬饲喂基础饲粮,B、C组在基础饲粮中分别添加1%、2%加味四君子汤.在14 d,全部犬解剖采样.分别在0、7、14 d,测定犬血清中D-木糖含量;解剖后测定胰腺中消化酶水平,肠道小肠EGF、SS的表达情况.【结果】在饲粮中添加加味四君子汤能显著提高犬血清中D-木糖含量(P0.05),提高胰腺中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶水平(P0.05),增加小肠EGF蛋白表达和EGF的mRNA相对表达量,减少小肠SS蛋白表达和SS的mRNA相对表达量;添加2%加味四君子汤优于添加1%加味四君子汤的效果.【结论】加味四君子汤可以提高犬血清中D-木糖含量、胰腺消化酶的水平和小肠中EGF的表达,降低SS的表达,增强犬消化吸收功能.     

大鳞副泥鳅GPR30基因的克隆及EE2暴露对其表达的影响

【目的】克隆大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor30)基因GPR30,研究其在成鱼各组织中的表达状况;用EE2(17α-ethynylestradiol)处理大鳞副泥鳅雌性幼鱼后,检测GPR30、ERαmRNA在幼鱼肝脏和卵巢中的表达状况,探究EE2对雌激素膜受体GPR30和经典雌激素核受体ERα基因表达的影响,推测GPR30可能存在的生理功能。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术,克隆大鳞副泥鳅GPR30,对其核苷酸序列及所编码的氨基酸序列信息和进化关系进行分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,研究GPR30mRNA在大鳞副泥鳅成鱼性腺、肠道、肌肉、肾脏、脑、肝脏、鳃、眼睛等组织中的表达状况,以及经不同质量浓度(1,5,25ng/L)EE2处理后雌性幼鱼肝脏和卵巢中GPR30和ERαmRNA的表达。【结果】克隆获得了GPR30,该基因全长2 152bp,阅读框全长1 062bp,编码353个氨基酸,该基因氨基酸序列与斑马鱼的GPR30氨基酸序列相似性最高,达92.9%。GPR30氨基酸序列的比对结果显示,大鳞副泥鳅与其他脊椎动物的GPR30结构域一致。荧光定量PCR分析表明,GPR30在大鳞副泥鳅成鱼卵巢中表达最高,在雄鱼肠道中表达最低,且GPR30mRNA在雌雄大鳞副泥鳅的性腺中差异性表达,在卵巢中的表达量较精巢中高702倍。EE2暴露试验显示,在5ng/L EE2处理组的卵巢及1和5ng/L EE2处理组的肝脏中,GPR30有略微增长;随着EE2质量浓度的增高,ERαmRNA在肝脏中的相对表达水平较对照组显著增长。【结论】成功克隆了大鳞副泥鳅GPR30,其与哺乳动物的GPR30有相似的结构和功能,可能与雌激素效应存在密切关系。在基因转录水平上,GPR30与ERα可能不存在直接的显著相关关系。     

猪雄性增强抗原1基因MEA1编码区克隆、表达及生物信息学分析

【目的】克隆猪MEA1基因编码区序列,获得基因表达谱并了解其蛋白质的基本功能。【方法】从GenBank下载猪及近缘物种MEA1序列作为参考序列,设计特异引物从版纳微型猪近交系(BMI)睾丸组织中扩增MEA1基因完全编码序列及部分侧翼序列,对MEA1翻译的蛋白质序列进行多种功能生物信息学分析并构建多物种系统进化树,最后用实时荧光定量PCR技术检测BMI 15个重要组织的MEA1 mRNA转录表达水平。【结果】扩增得到BMI MEA1编码区序列长525 bp,编码174个氨基酸。功能生物信息学分析表明:MEA1含有1个完整的保守结构域,无跨膜螺旋结构,无N端信号肽序列,二级结构以无规卷曲为主,N末端疏水,C末端均亲水,有3类功能活性位点。系统进化分析表明:MEA1基因在进化中高度保守,且与人、长臂猿的亲缘关系最近,符合物种的系统分类地位。多组织相对荧光定量表达分析表明:MEA1基因在睾丸中高表达,在心、肝等其他14个组织中低表达。【结论】为探索BMI MEA1基因在睾丸形成和精子发生过程中的作用及功能奠定基础。     

绿僵菌菌株MAX-2在应答胁迫过程中Hog1基因的表达

【目的】通过分析在逆境胁迫过程中绿僵菌菌株MAX-2的Hog1基因的转录表达,为揭示该菌株耐逆特性的分子机理提供理论依据。【方法】将具有不同耐逆能力的3个绿僵菌菌株MAX-2、BUM2495和BUM723的分生孢子分别用盐处理(0.4、0.8 mol/L Na Cl)和紫外线照射(5、15 min),测定孢子萌发率,并提取RNA,通过半定量RT-PCR方法分析其Hog1基因的转录表达差异。【结果】从盐和紫外线逆境条件下菌株的孢子萌发率可以看出:这3个菌株的耐逆性能为MAX-2BUM2495BUM723,菌株间的差异都达到了极显著水平(P0.01)。盐处理和紫外线辐射都能诱导绿僵菌Hog1基因的表达上调,不同菌株表达差异较大,MAX-2表达水平最高,BUM723表达水平最低。在较低程度的胁迫条件下(0.4 mol/L Na Cl和紫外线照射5 min),MAX-2的表达水平略高于BUM2495,而在较高程度的胁迫条件下(0.8 mol/L Na Cl和紫外线照射15 min)MAX-2的表达水平明显高于BUM2495,表明Hog1基因在较高程度压力条件下的高效表达与MAX-2的耐逆能力密切相关。【结论】绿僵菌菌株MAX-2较高的耐逆能力与其Hog1基因的高水平转录表达相关。     

缺氧诱导因子和促红细胞生成素及其受体基因在绵羊各组织中表达量

【目的】研究缺氧诱导因子(HIF)及其下游靶基因促红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)在绵羊正常生理状况下各组织的表达,为靶向调控或缓解绵羊缺氧应激的研究提供组织学依据。【方法】采用实时荧光定量PCR方法,检测4只新疆细毛羊14种组织中HIF、EPO和EPOR基因的相对表达量。【结果】HIF-1α和HIF-2α基因均在绵羊肺组织的相对表达量最高,且极显著高于其它组织(P<0.01);在肺脏HIF-2α基因的表达量约为HIF-1α表达量的5.2倍。EPO基因在绵羊肾脏的相对表达量最高且显著高于垂体、结肠、脾脏、盲肠、肝脏、肾上腺、瘤胃、下丘脑以及心脏(P<0.05)。EPOR基因在肺脏的表达量最高,肺脏和睾丸的相对表达量显著高于脾脏、下丘脑、肾脏、心脏等组织(P<0.05)。【结论】HIF-1α、HIF-2α和EPO及其受体基因在绵羊的肺部或肾脏的高表达,可能是绵羊缺氧应激感受及其调控的重要器官。     

人源JAZF1基因真核表达载体的构建及其对胚胎癌细胞凋亡的影响

【目的】构建人源转录因子锌指并列基因1(JAZF1)真核表达载体,并探究过表达JAZF1对胚胎癌细胞存活的影响。【方法】以胚胎癌细胞NCCIT的cDNA为模板扩增JAZF1基因片段,并将其与pRK5-myc载体连接,构建重组质粒,转染至NCCIT细胞;通过实时荧光定量PCR和DAPI染色法分别检测过表达JAZF1对NCCIT细胞中炎性因子IL1-β、IL8、TGF-β转录水平的影响及对NCCIT细胞存活的影响。【结果】过表达JAZF1基因后,促炎因子IL1-β(P <0.05)、IL8(P <0.01)转录水平明显下降,而抑炎因子TGF-β的mRNA表达水平无明显变化(P>0.05),同时NCCIT细胞出现更明显的细胞凋亡(P<0.01)。【结论】JAZF1可能通过抑制促炎因子IL1-β和IL8的表达来抑制炎症发展,进而抑制畸胎瘤进展。     

加味四君子汤对脾虚犬小肠紧密连接蛋白表达及ERK/MAPK通路的影响

【目的】从ERK/MAPK通路的角度探讨加味四君子汤对脾虚犬小肠紧密连接蛋白表达的影响。【方法】将24只1岁龄健康比格犬随机均分为对照组、脾虚组、自然恢复组和加味四君子汤组。采用番泻叶药液复制脾虚模型犬,模型构建成功后,脾虚组犬处死采样,对照组和自然恢复组犬饲喂基础日粮,加味四君子汤组犬在基础日粮中添加2%(以生药计)加味四君子汤。试验期14 d。试验结束时各组试验犬解剖采集十二指肠、空肠和回肠,应用免疫组织化学(IHC)、荧光定量PCR、蛋白质印迹法(Western-blot,WB)检测相关指标。【结果】脾虚组试验犬小肠ZO-1和Occludin蛋白阳性表达水平,ZO-1和Occludin mRNA相对表达量,ZO-1、Occludin及ERK/MAPK相关通路蛋白表达量均显著低于对照组试验犬(P0.01);经加味四君子汤治疗后试验犬上述指标较治疗前均显著升高(P0.01),趋近对照组水平。【结论】试验犬脾虚证候与小肠紧密连接蛋白的低表达密切相关,小肠机械屏障功能降低;加味四君子汤可以显著提高脾虚犬小肠紧密连接蛋白的表达水平,其调节机制可能是通过活化ERK/MAPK通路来实现。