克隆猪隐睾症雌雄激素及其受体基因表达的研究

利用化学发光免疫技术测定了3头隐睾克隆猪和3头正常猪不同阶段(2—6月龄)的睾酮(T)和雌二醇(E_2)激素的水平;运用相对荧光定量PCR技术检测AR和ER基因在睾丸组织中的mRNA表达量。结果表明:正常猪血清T和E_2浓度从2月龄到6月龄呈上升趋势,隐睾克隆猪血清E_2浓度变化趋势与对照组相似,T变化趋势为先缓慢升高然后降低,5月龄达到最高[(1.98±1.06)ng/mL],且各阶段血清浓度均显著低于正常猪;ER基因在克隆猪睾丸中表达量高于对照组,但差异不显著,AR基因表达量则反之,且差异显著。血清T的低水平和睾丸AR基因mRNA低表达均可能是引起克隆猪发生隐睾的因素。     

雄激素受体及共调节因子在睾酮调节绵羊附睾GPX5表达中的作用分析

为探究雄激素受体(Androgen receptor,AR)及共调节因子对绵羊附睾上皮细胞(Epididymal epithelial cells,EECs)谷胱甘肽过氧化物酶5(Glutathione peroxidase 5,GPX5)的调节机制,本研究采用CCK-8检测睾酮对EECs增殖的影响;利用qRT-PCR、免疫荧光法和 Western Blot法分别检测AR、GPX5、甾体激素受体共激活子 1(Steroid receptor coactivator 1,SRC-1)、CREB结合蛋白(cAMP-response element-binding protein,CBP)、p300和核受体共抑制因子2(Nuclear receptor corepressor 2,NCOR2)的mRNA水平和蛋白表达情况,采用双荧光素酶报告基因测定干扰SRC-1或p300后EECs的荧光素酶活性。结果表明:1)与对照组相比,100 nmol/L睾酮组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量极显著升高(P<0.01),1 000 nmol/L睾酮组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量差异不显著(P>0.05),但分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)低于100 nmol/L睾酮组;100 nmol/L睾酮组细胞中的AR mRNA和蛋白表达量分别呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于对照组,然而1 000 nmol/L睾酮组细胞中的AR mRNA和蛋白的表达量显著低于对照组(P<0.05);1 000 nmol/L睾酮组细胞中的CBP、p300、SRC-1蛋白表达极显著高于对照组(P<0.01),特别是核内的表达量明显增高。2)与对照组相比,siRNA-AR组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白的表达量差异不显著(P>0.05),而SRC-1和p300蛋白表达量极显著升高(P<0.01)。pcDNA3.1-AR组GPX5 mRNA和蛋白表达量较对照组呈极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)升高。3)siRNA-SRC-1 和siRNA-p300组细胞中的GPX5 mRNA和蛋白表达量较对照组均显著降低(P<0.05),而AR的蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05),AR的转录活性显著降低(P<0.05)。综上,睾酮对绵羊EECs GPX5、AR及其共调节因子的表达具有浓度依赖性的调节效应,睾酮通过AR及其共调节因子SRC-1和p300/CBP的协同调节GPX5表达。本研究为探究GPX5在绵羊附睾中的调节机制提供理论依据。     

草莓八氢番茄红素合成酶基因的克隆及其表达特性

 【目的】分离和克隆草莓果实八氢番茄红素合成酶基因psy,分析其序列特征,了解其在不同组织部位的表达情况。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆草莓类胡萝卜素合成途径中关键基因psy,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用半定量PCR法研究psy基因在不同组织中的表达。【结果】分离到psy基因,GenBank登录号为FJ784889。该cDNA全长1 458 bp,具有1个1 194 bp的完整开放阅读框(ORF),编码398个氨基酸。序列分析表明,psy编码的氨基酸序列与其它植物的PSY蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,草莓PSY与胡萝卜和玉米的PSY蛋白亲缘关系比较近。原核表达结果表明psy基因在大肠杆菌中获得高效表达。利用半定量RT-PCR技术进行组织表达模式分析发现,psy基因在草莓的花、叶片和果实中均有表达。表达量为花＞红果＞粉红果＞白果＞青果＞老叶＞新叶。【结论】从草莓中克隆到类胡萝卜素生物合成的关键酶基因psy,该基因可能参与调控类胡萝卜素的合成。     

四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸高效液相色谱分析方法的建立与应用

采用ODS分离柱(250 mm×4.6 mm i.d.)、恒组成流动相(8.5% CH3CN-33 mmol·L-1磷酸缓冲液,pH 3.0)并结合荧光检测的高效液相色谱(HPLC)技术,可以对生物体内重要的叶酸存在形态,四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸进行分析定量;将这种检测方法应用于亚甲基四氢叶酸还原酶和甲硫氨酸合成酶的活性分析,不需要使用放射性同位素,并且具有检测灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单迅速的特点.使用抗坏血酸、巯基乙醇或二硫苏糖醇,在检测过程中叶酸化合物和酶保持稳定;反应体系中也没有任何试剂会干扰反应产物四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的HPLC检测.     

鹤望兰二氢黄酮醇-4-还原酶基因SrDFR的克隆及表达分析

采用RT-PCR方法从鹤望兰蓝色花瓣中克隆到类黄酮合成途径关键基因 S rD FR ,该片段长246 bp ,编码82个氨基酸。氨基酸同源性分析表明, SrDFR推导的氨基酸序列与已报道的其他植物的DFR蛋白具有很高的同源性。系统进化树分析显示,鹤望兰 S rD FR与姜荷花聚为一类,亲缘关系较近。应用半定量 PCR分析表明, S rD FR在蓝色花瓣中高表达,在黄色花萼和叶片中低表达,且在花发育的始花期表达量最高,表明该基因在蓝色花瓣发育过程中起着重要作用。     

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)基因在烟草中的过量表达

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花青素合成途径中的关键酶,它在花色的修饰中起着很重要的作用,在烟草植物体内过量表达积累后,可能会使烟草的花色加深或变为红色。研究结果表明,通过转基因技术将NtDfr1,NtDfr2基因转入烟草后,获得转基因植株烟草的花色为红色,这与试验预期结果一致。     

杨树二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)的克隆及反义表达对儿茶素合成的影响

为了验证二氢黄酮醇-4-还原酶基因(DFR)在杨树上的功能,明确DFR对抗病物质儿茶素合成的影响,利用抗病基因防治树木溃疡病提供候选基因。以接种欧美杨细菌性溃疡病菌后6 d的一年生中林46杨树苗干的树皮为材料,利用RT-PCR技术克隆DFR基因的ORF序列,并构建DFR的反义表达载体anti-p BI121-DFR。采用农杆菌介导叶盘法转化84K杨,获得了转反义DFR基因的84K杨4株。用高效液相色谱法检测转基因植株叶片中的儿茶素质量分数,结果显示,4株转反义DFR株其内源儿茶素质量分数分别为0.97、2.4、1.6和0.87 ng/g,与84K野生型植株中儿茶素质量分数(8.9 ng/g)相比显著降低。上述结果表明DFR基因参与了杨树类黄酮生物合成途径,该基因与儿茶素的合成有关。     

外源雄激素促进绵羊附睾GPx5基因的表达

为研究外源雄激素丙酸睾酮对绵羊附睾特异表达基因谷胱甘肽过氧化酶5(GPx5)的影响,应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清和附睾头部内睾酮(T)、二氢睾酮(DHT)的含量,及附睾头部雄激素受体(AR)蛋白表达量;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了附睾头部GPx5-mRNA和AR-mRNA相对表达量;并结合免疫印迹(WB)法检测了附睾头部GPx5蛋白相对表达量。结果表明:丙酸睾酮处理(TPT)组与对照组相比绵羊血清DHT含量,附睾头部T含量、DHT含量均显著提高,分别是对照组的0.5、6.0、0.8倍;GPx5-mRNA和ARmRNA相对表达量显著提高,分别是对照组的0.75和0.77倍(P0.05);AR及GPx5蛋白表达量显著提高,分别是对照组的0.63和0.58(P0.05)。因此,外源雄激素丙酸睾酮可大量提高绵羊附睾头部GPx5基因的表达,对绵羊附睾头部GPx5基因的表达具有促进作用。     

洋葱二氢黄酮醇-4-还原酶基因的分子克隆

鳞茎的皮色是洋葱的重要经济性状之一。洋葱的二氢黄酮醇-4-还原酶基因AcDFR1的开放阅读框为1158bp,编码385个氨基酸残基;具有5个内含子,均符合GT—AG规则。本研究为阐明洋葱皮色形成的分子机制以及开发分子标记奠定了基础。     

犬α1干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性研究

亚克隆犬α1干扰素(CaIFN-α1)成熟蛋白编码基因并克隆到表达载体pPICZα-A,构建转移重组载体pPICZα-A-CaIFN-α。pPICZα-A-CaIFN-α经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。转化子经PCR分析鉴定后利用甘油增菌和甲醇诱导,实现了CaIFN-α1在毕赤酵母系统中的分泌表达。SDS-PAGE检测结果表明表达产物相对分子质量约为2.7×104,比其推导结果(约1.9×104)大,推测可能是发生了糖基化。酵母分泌表达的CaIFN-α1具有较高的抗病毒活性,约为1.45×106U·mL-1,蛋白含量约为96mg·L-1,比活性为1.49×107U·mg-1。重组CaIFN-α1的生物学活性具有较强的种属特异性,在犬肾细胞(MDCK)上具有很高的抗病毒活性,在鸡胚成纤维细胞上活性较低,而在猫肾细胞(F81)和牛肾细胞(MDBK)上几乎没有抗病毒活性。进一步研究发现,重组犬α1干扰素对犬瘟热病毒和伪狂犬病毒在犬肾细胞中的增殖具有显著抑制作用。     

蒺藜苜蓿二氢黄酮还原酶基因的克隆与原核表达

以蒺藜苜蓿(Medicargo trunctula)幼果为试材,采用RT-PCR方法克隆到二氢黄酮还原酶(DFR)基因的cDNA片段.该片段全长1 018bp,与GenBank中已注册的DFR基因同源性为99.8%,编码334个氨基酸;构建DFR基因原核表达载体pETDFR,DFR在原核表达系统中得到了高效表达,获得预期大小(38.1ku)的酶蛋白分子.原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致.     

金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）的克隆及序列分析

 【目的】克隆金荞麦二氢黄酮醇4-还原酶基因（FdDFR1）,分析其序列特征。【方法】利用同源克隆的原理,采用RACE结合cDNA文库筛选的方法,从金荞麦cDNA文库中克隆DFR基因（FdDFR1）;对其序列进行生物信息学分析和Southern杂交检测。【结果】克隆到一个DFR蛋白基因（FdDFR1）,通过Southern杂交分析,推测在金荞麦基因组中DFR基因是1～2个基因的小家族,FdDFR1是单拷贝基因;FdDFR1基因编码一个长341个氨基酸的蛋白质,在N端存在一个NADP结合位点“VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY”,还存在一个底物结合特异性决定的氨基酸基序“TVNVEEKQKPVYDETCWSDVDFCRRV”。【结论】首次从金荞麦中克隆到类黄酮代谢的中期关键酶基因（FdDFR1）,它具有DFR同源基因的典型特征。     

丙酸睾酮对小鼠睾丸NT-3和NT-4表达的影响

以30日龄雄性小鼠为研究对象,用丙酸睾酮分别处理小鼠6,12,24 h后收集睾丸,提取睾丸总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量和Western-Blot方法探究了雄激素对睾丸中神经营养因子NT-3及NT-4表达的影响。荧光定量结果表明:丙酸睾酮处理小鼠,12 h组和24 h组NT-3及NT-4的表达显著升高,其他各组间无显著差异。Western-Blot结果与荧光定量结果一致。说明丙酸睾酮能够调节小鼠睾丸中NT-3和NT-4的表达。     

热应激对兔下丘脑-垂体-睾丸轴NMB及其受体基因 表达和睾酮分泌的影响

研究热应激对公兔下丘脑-垂体-睾丸(HPT)轴神经介素B(NMB)及其受体(NMBR)基因表达水平及血清皮质醇和睾酮分泌的影响,探讨热应激对神经肽和相关激素分泌的影响。建立热应激模型,采用荧光定量PCR (RT-PCR)检测兔NMB和NMBR m RNA在HPT轴的表达情况,采用放射免疫分析法(RIA)检测兔血清中皮质醇和睾酮浓度的变化规律。结果表明,兔NMB和NMBR基因在HPT轴中表达;NMB和NMBR m RNA在HPT轴的表达模式相似,且热应激后在一定程度上可以促进NMB和NMBR基因的表达,并按时序在下丘脑(热应激0.5 h)、垂体(热应激1.0 h)和睾丸(热应激2.0 h)促进作用最为明显;热应激可以促进皮质醇的分泌,并抑制睾酮的分泌,但这种抑制作用随着热应激时间的增加(热应激2.0 h)逐渐恢复正常。表明热应激可能通过NMB/NMBR系统调节HPT轴的功能,进而影响动物繁殖。     

‘红肉脐橙’八氢番茄红素合成酶基因的克隆与原核表达

【目的】克隆、分析‘红肉脐橙’（Citrus sinensis Osbeck cv. Cara Cara）八氢番茄红素合成酶（phytoene synthase,PSY）基因,并进行原核表达。【方法】以‘红肉脐橙’果实中分离的mRNA为模板,通过RT-PCR扩增到PSY cDNA片段,并分析其序列;利用PCR技术获得‘红肉脐橙’PSY cDNA的编码区全长,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+),获得重组质粒pET-CitPSY转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达。【结果】‘红肉脐橙’PSY cDNA长1 520 bp,最大开放读码框为1 308 bp,可编码436个氨基酸,核酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物PSY核酸、氨基酸序列之间的相似性分别在75%和70%以上,并且发现‘红肉脐橙’PSY的N末端存在转运肽信号序列,成熟的PSY包含1个跨膜结构域。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白6×His-PSY,Western-blot试验证实表达的融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应,分子量约为52 kD。【结论】该研究为进一步开展柑橘果实色泽分子改良奠定了基础。     

二苯并-18-冠-6双硫脲衍生物识别磷酸二氢盐的研究

冠醚对碱金属离子具有高选择性的配合能力.硫脲作为电中性物质,其平面三角形的极性氢键可作阴离子的识别位点.作者合成了二苯并-18-冠-6-双硫脲衍生物,研究了它们对不同无机盐NaH2PO4·2H2O,KH2PO4相互作用的性质,用红外光谱、核磁共振谱进行了表征.     

双氢杨梅素在家兔体内的药动学研究

[目的]研究双氢杨梅素在家兔体内的药动学特征。[方法]经单剂口服给药后,收集家兔血样,经离心后,采用紫外分光光度法于280 nm波长处进行血药浓度测定。[结果]双氢杨梅素的血药浓度—时间曲线符合一级消除的单室模型,Ke为(0.76±0.13)h-1,Ka为(0.85±0.24)h-1,t1/2(Ka)为(0.82±0.31)h,t 1/2(Ke)为(0.91±0.44)h,Tmax为(1.5±0.46)h,Cmax为(12.36±2.7)mg/L,AUC0→∞为(45.45±22.3)mg.h/L,CL/F为(4.71±1.21)L/(h.kg),V/F为(6.17±3.12)L/kg。[结论]该方法简便、可靠、灵敏,适用于双氢杨梅素的药动学研究。     

甜瓜果实八氢番茄红素合成酶基因的克隆及正义表达载体的构建

根据C,enBank中登记的甜瓜八氢番茄红素合成酶（CmPSY）基因序列设计引物,利用lit—PCR技术克隆了甜瓜PSY全长基因,该基因全长1443bp,编码421个氨基酸,在GenBank中登记号为GU361622。以＆帆HI和剐I双酶切pMDI8-T—CmPSY和表达载体pBI121,再将回收的目的片段与pBI121用T4 DNA连接酶连接,结果证明,渊y正向插入到pBI121中,得到了pBI121-CmPSY的重组质粒。该研究为了解甜瓜八氢番茄红素合成酶的活性调节机制,并通过基因工程手段研究甜瓜PSY的活性奠定了基础。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

PCR介导观赏向日葵DFR基因改造及其真核表达载体构建研究初报

二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花色素苷代谢途径中的关键酶之一.本研究利用PCR技术将观赏向日葵DFR底物结合区敲除,并将该区域中134位保守氨基酸天冬酰胺定点突变为天门冬氨酸和亮氨酸,最后获得已敲除底物结合区的基因KODFR以及定点突变的基因N134D和N134L,并成功构建KODFR、N134D和N134L基因的植物表达载体pCAM-KODFR、pCAM-N134D和pCAM-N134L.