苹果愈伤组织SSR-PCR反应体系优化

以"嘎啦"苹果组培苗叶片诱导的愈伤组织作为DNA模板提取材料,采用正交设计,摸索了SSR反应体系中Mg~(2+)、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA、dNTP的最适浓度,可为苹果愈伤组织的遗传变异研究奠定基础。结果表明:各因素不同水平变化对反应体系的影响为Taq DNA聚合酶dNTP用量Mg~(2+)用量引物用量=模板DNA浓度。确立了苹果愈伤组织SSR-PCR最佳反应体系总体积25μL,其中4μL 25mmol·L~(-1) Mg~(2+),0.25μL 5U·μL~(-1) Taq DNA聚合酶,3μL 0.01mmol·L~(-1) SSR引物,1μL 30ng·μL~(-1)模板DNA,4μL 2.5mmol·L~(-1)dNTP,2.5μL 10×PCR Buffer,10.25μL超纯水。     

两种独行菜种子cDNA-SRAP反应体系的建立及优化

以2种独行菜种子为试材,采用cDNA-SRAP技术,研究了dNTPs、Mg~(2+)、上下游引物、cDNA模板、Taq DNA聚合酶浓度等5个因素对独行菜cDNA-SRAP反应体系扩增结果的影响,以期得到适合2种独行菜种子的cDNA-SRAP反应体系,并且对cDNA-SRAP扩增条件进行了优化。结果表明:优化的最佳cDNA-SRAP反应体系(20μL)为10×PCR buffer,cDNA模板用量100ng,Mg~(2+)浓度1.75mmol·L~(-1),dNTPs浓度0.275mmol·L~(-1),引物浓度1.0μmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶用量0.5U;利用优化的cDNA-SRAP反应体系能够扩增获得清晰、数目多的条带,可用于后续深入研究2种独行菜不同处理下差异表达基因。     

正交设计直观分析法优化苦瓜SSR-PCR反应体系

以苦瓜‘MC9’为试材,采用L16(45)正交实验,对苦瓜SSR-PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTPs浓度、模板DNA量、Taq聚合酶量、引物浓度等5个因素的4个水平进行优化试验,并通过正交设计直观分析法对Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq聚合酶量进行了单因素确定。结果表明:最佳反应体系为1μL 10×PCR buffer,Mg2+浓度为1.75mmol·L~(-1),dNTPs浓度为0.25mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1U,DNA 100ng,引物0.20mmol·L~(-1),ddH2O补足至10μL。     

酸枣SSR-PCR反应体系优化

以3个酸枣品系LW1、LW2、LW23为试材,以大枣品种"三星"为对照,采用L16(45)正交实验设计,研究了酸枣SSR-PCR的反应体系,以期为酸枣SSR分子标记研究提供参考依据。结果表明:酸枣SSR-PCR的最佳反应体系为,总体系为20μL,DNA模板量100ng、引物浓度0.5μmol·L~(-1)、Mg2+浓度1.25mmol·L~(-1)、Taq聚合酶量1.5U、dNTPs浓度0.3mmol·L~(-1)。利用该体系,选择引物JSSR250对53个酸枣品系和8个大枣品种的DNA进行扩增,酸枣的扩增产物在140~180bp,具7个等位基因,目标条带清晰,多态性良好。该体系能够应用于酸枣SSR分子标记研究。     

粉枝莓SCoT分子标记的PCR反应体系建立

以粉枝莓为试材,以改良CTAB法提取的基因组DNA为模板,从引物、dNTPs、Mg~(2+)浓度以及退火温度4个因素,对SCoT-PCR反应体系进行了优化,以建立适合粉枝莓SCoT-PCR最佳扩增体系。结果表明:SCoT-PCR反应体系的最佳条件为dNTPs 0.125mmol·L~(-1)、Taq DNA聚合酶0.15μL、引物1.0μmol·L~(-1)、Mg2+0.625mmol·L~(-1)、模板40ng、反应体积20μL、退火温度为51℃。该优化体系扩增的产物条带清晰,稳定性高。     

大葱ISSR反应体系的建立及优化

以大葱嫩叶为试材,采用单因素试验和正交实验探讨了Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、TaqDNA聚合酶用量、模板DNA以及Buffer用量对大葱ISSR-PCR扩增的影响,建立了大葱ISSR反应体系。结果表明:优化后的最佳反应体系为10μL反应体系中,10×Buffer缓冲液1.0μL,Mg~(2+)浓度为2.0mmol·L~(-1),dNTPs浓度为0.3mmol·L~(-1),引物浓度为0.65μmol·L~(-1),Taq酶1.0U,模板DNA为60ng,用灭菌的超纯水补齐体积至10μL。对大葱71份样品材料进行ISSR-PCR扩增体系的检测结果显示,该优化体系扩增的产物条带清晰,稳定性高,为大葱种质ISSR分子标记遗传结构分析提供参考依据。     

基于PAGE检测技术的平菇ISSR-PCR体系的建立和优化

以平菇"唐平26"基因组DNA为模板,以U836为引物,比较了琼脂糖凝胶电泳和不同浓度聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)电泳对ISSR-PCR产物的分离效果,并且采用PAGE电泳技术对影响ISSR反应体系的主要因素进行优化。结果表明:以PAGE电泳技术检测平菇ISSR-PCR产物的效果最好,最佳ISSR-PCR反应体系为,在20μL反应体系中,模板20ng,Mg2+浓度为1.5mmol·L~(-1),引物0.8μmol·L~(-1),dNTPs 200μmol·L~(-1),Taq酶1.0U,30个扩增循环。     

白芨SCoT分子标记技术体系的建立及其在快繁苗遗传稳定分析中的应用

以4个不同继代的白芨快繁苗为试材,采用L_(16)(4~5)正交实验设计,建立了白芨SCoT-PCR的反应体系,并利用该体系分析不同继代的白芨快繁苗遗传稳定性。结果表明:白芨的SCoT-PCR最佳反应体系(20μL)中包含2.500 mmol·L~(-1) Mg~(2+),0.25mmol·L~(-1) dNTPs,1.50 U Taq DNA聚合酶,1.000μmol·L~(-1)引物,10ng模板DNA。遗传稳定性分析发现,SCoT引物均能在4个不同继代的白芨快繁苗中扩增出清晰、丰富而稳定的条带,但每个引物的条带均无多态性。说明白芨快繁苗并未发生变异,其遗传稳定性较好。     

青海地方核桃ISSR-PCR反应体系建立及优化

以青海地方核桃嫩叶为试材,采用正交设计对ISSR-PCR反应体系中主要影响因子进行了优化,以建立反应的最佳条件。结果表明:青海地方核桃20μL ISSR-PCR最佳反应体系为0.45 mmol·L~(-1) dNTP、0.5μmol·L~(-1)引物、1.75 mmol·L~(-1) Mg~(2+)、0.75 U Taq酶和80ng DNA。     

新疆野苹果SSR-PCR反应体系的优化

以新疆野苹果叶片为试材,采取改良CTAB法提取基因组,参照基本PCR反应体系,采用控制变量的方法,研究了各成分不同的浓度梯度对新疆野苹果SSR-PCR扩增的影响,为新疆野苹果的遗传育种奠定基础。结果表明:新疆野苹果SSR扩增的最佳体系为10×PCR buffer 2.5μL,dNTP 0.2mmol·L~(-1),0.2mmol·L~(-1)引物,0.5UTaq DNA聚合酶,100ng DNA模板。并用此优化体系对154份新疆野苹果进行了稳定性、普遍性验证,扩增效果较好。