2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析北大核心CSCD

【目的】克隆新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schlecht.)自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因SRNase全长序列,为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆S-RNase基因全长,采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析,利用CDD、Prot Param、Tmpred、Signal P、Target P、SOPMA、DANMAN、MEGA6和Prot Fun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到Pt S16-RNase基因和Pt S17-RNase基因,2者均属于RNase T2基因家族,与其他多种植物的S-RNase基因的序列相似度为83%~98%,序列均具有S-RNas蛋白典型结构。Pt S16-RNase基因ORF长690 bp,编码229个氨基酸,Pt S17-RNase基因ORF长678 bp,编码225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白,二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为主,在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性,可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。     

扁桃SLF基因和S-RNase基因的克隆及表达分析

 以扁桃‘Pioneer’品种为材料, 利用RT-PCR及RACE技术, 克隆了1个新的SLF ( S LocusF-box ) 基因(PdSLF1) 和两个新的S-RNase基因( PdSm 和PdSn) 的cDNA。PdSLF1全长1 331 bp, 编码376个氨基酸; PdSm 全长826 bp, 编码228个氨基酸; PdSn基因全长878 bp, 编码227个氨基酸。与公共数据库中的序列进行相似性比较, 发现这3个基因所编码的氨基酸序列与其它蔷薇科植物相应基因的氨基酸序列均具有较高的一致性, PdSLF1为70.2% ～84.8% , S-RNase为59% ～83.9%。PdSLF1基因在花药中专一性表达, 而PdSm 和PdSn基因在雌蕊中专一性表达。     

新疆野扁桃五个自然分布居群S基因型的鉴定及发生频率分析

以新疆野扁桃5个自然分布居群的150个株系为试材,采用生物统计学的方法,研究了新疆野扁桃5个自然分布居群的S基因类型及其发生频率。旨在为新疆野扁桃资源的有效保护与合理利用及该物种自交不亲和性进化机理提供科学依据。结果表明:在受试株系中共鉴定出6个S-RNase基因,S基因型有11种类型,各基因型组成在不同居群中的存在比率是不均等的,有占主导地位的S基因型;还有一些S基因型是某个居群特有的;也有一些S基因型出现的比率很低,变化差异较大;表明S-RNase基因经历了一定的进化历程。     

欧李自交不亲和S-RNase基因型鉴定及序列分析

以欧李4个品种为试验材料,采用同源克隆的试验方法,克隆S-RNase基因并分析其序列特征,确定不同品种基因型,以期为欧李杂交育种亲本选择提供参考依据。结果表明:克隆鉴定得到5个新的S-RNase基因,编码氨基酸168～172个,相对分子质量为19.87～20.34 kDa,等电点(PI)为9.60～9.73,以丝氨酸磷酸化为主;二级结构主要以α-螺旋和不规则卷曲为主;同源性比对和结构分析表明,5个新的S-RNase均属于RNase T2基因家族,推导的氨基酸序列包含5个保守区(C1、C2、C3、RC4和C5)和1个高变区(HV),具有与李属、梨属、苹果属S-RNase相似的保守结构;进化分析显示欧李S-RNase与李属果树S-RNase聚类在一起,亲缘关系较近。     

2个中亚杏S-RNase基因全长的克隆与序列分析

【目的】克隆中亚杏(Prunus armeniaca)品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列,为分子手段调控杏自交不亲和性状奠定基础。【方法】以新疆栽培杏品种‘索格佳娜丽’和‘赛买提’为试材,利用RT-PCR克隆2个品种的花柱SRNase基因c DNA片段,RACE技术进行c DNA全长克隆,采用BLAST进行序列比对,Protparam软件分析2个基因的编码蛋白特性,MEGA 5.0构建进化树。【结果】从‘索格佳娜丽’中克隆了S_(52)-RNase(KF951503)基因,从‘赛买提’中克隆了一个新的S_(53)-RNase(KF975455)基因DNA和c DNA全长序列。S_(52)-RNase的DNA全长2 200 bp,c DNA全长765 bp,ORF(开放阅读框)长681 bp,编码226个氨基酸;S_(53)-RNase的DNA全长1 664 bp,c DNA全长907 bp,ORF长732 bp,编码242个氨基酸。BLASTP比对显示:这2个基因都具有保守的RNase-T2基因结构,属于RNase-T2家族。预测相对分子质量分别为26.5 ku和27.5 ku,等电点为9.36和9.03,都属于亲水性蛋白。进化分析表明,S_(52)与李(Prunus salicina,S_7)、S_(53)与大岛樱(Prunus speciosa,S_(13))亲缘关系最近,S_(52)和S_(53)处在2个不同的分支上,表现出较高的序列多态性,表明2个基因亲缘关系较远。【结论】获得了2个中亚杏品种自交不亲和花柱S-RNase基因全长序列。     

白梨新S基因的克隆

 采用PCR - RFLP检测、DNA序列分析和田间杂交试验, 从白梨中分离鉴定了1个新的S-RNase基因。该S-RNase基因PCR扩增产物大小与S-RNase基因PCR产物相似, 为450 bp左右。但PCR -RFLP和DNA序列分析均表明, 它与S₈-RNase基因存在较大差异, 该基因内含子为252 bp, 而S₈-RNase的内含子为234 bp, 并在高变区中具有10个氨基酸出现替换, 有两个氨基酸出现缺失。而该S-RNase基因却与S₁₂-RNase基因具有较高的相似性, 在HV区中只有1处碱基被替换, 周边区中有10处出现碱基替换或缺失。因此, 继梨S18-RNase基因, 将它命名为S₁₉-RNase基因(AY250987) 。与S 基因型已确定的梨品种的杂交坐果率也说明了该基因是一个新的S-RNase基因。     

扁桃SFB基因的克隆及其生物信息学分析

以新疆扁桃栽培品种麻壳的花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,克隆到了一个全长为1131bp的SFB基因(Genbank登录号为:EU909685),命名为AcSFB10。该基因编码376个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序。经生物信息学分析,推测AcSFB10蛋白的分子式为C2000H3033N517O558S23,相对分子质量为43985.5,等电点为6.02,二级结构以α螺旋为主;理论推导半衰期大约为30h,不稳定参数为53.21,属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起裂合酶的作用,特异性的识别底物,正好吻合了F-box蛋白的作用。     

20个中国李品种自交不亲和S-RNase基因型的鉴定

利用蔷薇科S-RNase通用引物Pru-C2/PruCE-R以及12对特异性引物,对贵州省栽培的20个中国李(Prunus salicina Lindl.)品种叶片DNA进行PCR扩增,鉴定其S基因型。结果表明：采用S-RNase通用引物,仅11个李品种扩增出2个条带;采用12对S-RNase特异性引物,既扩增出与通用引物一样的结果,又鉴定出2个品种的S基因型。共鉴定了13个中国李品种完整的S基因型：红心李S_hS₁₀,姜黄李S₁₀S₂₀,南方李S_iS₉,柰李S_hS_f,槜李S_hS₇,幸运S_bS_c,芙蓉李S_bS_i,大红袍S_dS₂₀,前卫红S_eS_h,玫瑰皇后、澳得罗达、黑宝石和秋姬李S_b     

新疆野生樱桃李S-RNase基因分离与鉴定的初步研究

 从4对已报道的李属树种S-RNase基因引物组合中筛选出扩增效果较好的PruC2和PruC4R组合,首次对新疆野生樱桃李（Prunus cerasifera Ehrh.）的45个株系的基因组DNA进行S-RNase基因特异性PCR扩增,并对其PCR产物进行克隆测序。这些核酸序列及其相应的氨基酸序列在GenBank中进行比对, 皆与李属的S-RNase基因有最大同源性,为新疆野生樱桃李的4种S-RNase基因,分别命名为S₁ （511 bp）,S₂ （787 bp）,S₃ （1859 bp）和S₄ （464 bp）,在GenBank的登录号分别为EF638726、EF641276、EF661873和EF661874。45个株系中,43个株系的S基因型分别为S₁S₂、S₁S₃、S₂S₃、S₂S₄和S₃S₄,而10号和15号株系分别只鉴定了一种S-RNase基因,其S基因型组成有待于进一步研究。     

新疆蔷薇科扁桃类植物自交不亲和性的分子机制

蔷薇科扁桃类植物是具有重要经济、研究价值的园艺果树类植物,该类果树植物家族均为自交不亲和性,自花授粉并不能正常结实,在其生长和生产过程中都需要进行异花授粉。扁桃类果树植物的自交不亲和属于配子型自交不亲和类型,是由花粉配子体核基因决定花粉与雄蕊的不亲和反应,即当花粉中的一个S等位基因与花柱中的一个等位基因相同时即表现不亲和。不亲和反应的细胞学特征是花粉管生长在花柱中受阻。该文对植物自交不亲和性方面的分子机制在蔷薇科扁桃类果树作物上的反映研究进展进行了综述,并着重阐述了新疆分布的独特的栽培扁桃和野生扁桃自交不亲和性S-位点基因的研究进展,以期为今后更深入的研究提供了重要的基础。     

新疆野扁桃TP-M13-SSR引物的多态性分析

以来自5个居群的96份新疆野扁桃叶片为试材,采用TP-M13-SSR技术和毛细管荧光电泳检测的方法,分析新疆野扁桃TP-M13-SSR引物的多态性,以期为该珍稀植物的保育工作提供参考依据。结果表明:新疆野扁桃TP-M13-SSR引物库中包含23 627条序列,共有5类重复类型,以二核苷酸类型数量最多,五、六核苷酸数量极少。将12对核心引物与96份样品一同扩增后,等位基因数(No.of allele)均为2个,有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、固定指数(F)、香农指数(I)、特异等位基因(Na)、多态性信息含量指数(PIC)、标记指数(MI)、Nei′s多样性指数、遗传相似性系数(Gst)、基因流(Nm)的范围分别为:3.531 0~9.000 0、0~0.666 7、0.72~0.89、0.25~1.00、1.48~2.44、8~18、0.669 0~0.879 0、5.35~15.82、0.219 5~0.430 8、0.002 0~0.042 6、34.756 0~252.196 4。这12对引物中,引物PT-9的多态性最好,引物PT-1多态性最差。     

桃果肉颜色、果皮茸毛和花粉育性性状的分子标记

 以91-42-51 ×瑞光2号的杂交后代共48个单株为试材, 采用集群分离分析法(BSA) , 对桃果实的有毛/无毛、白肉/黄肉以及无花粉/有花粉3 个性状进行了分子标记研究。研究获得SSR 标记UDP96-018 (300 bp) 与有毛性状连锁, 遗传距离4.5 cM, SSR标记UDP98-407 (680 bp) 与白肉性状连锁, 遗传距离为2.2 cM; 根据拟南芥雄性不育序列标记设计的引物扩增出的两个片段NNJ-I (600 bp ) 和NNJ-I (900 bp) 与桃无花粉性状之间的遗传距离为0 cM。这些标记的获得为桃分子标记辅助育种提供了有效的筛选手段。     

新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因的检测

 为系统鉴定新疆主栽杏品种自交不亲和SFB基因型,以新疆25个主栽杏品种为试材,利用蔷薇科保守序列设计引物对叶片基因组DNA进行SFB基因特异PCR扩增,筛选出有效的扩增引物;对成功扩增的杏品种的特异条带克隆测序,在GenBank上进行BLASTN比对,确定各品种的SFB基因型。结果显示：引物组合Ⅱ-1、Ⅳ-2,1-Ⅰ、1-Ⅱ对新疆杏品种的扩增效果最好,成功地在18个品种上扩增出了5种大小不同的条带,14种不同的基因型,其中两     

白梨品种4个新S基因的分离与鉴定

利用S_1-8-RNase氨基酸保守序列‘FTQQYQ’和‘IIWPNV’设计兼并引物, 对白梨4个品种冬黄、新梨一号、红皮酥和博山池的基因组DNA进行PCR扩增。PCR产物限制性酶切分析显示: 新梨一号和冬黄各含有一个S₈ - 等位基因。DNA序列测定和生物信息学分析表明, 这4个品种中含有与已报道的S_1-19等位基因有差异的S基因, 经分析鉴定为新的S 等位基因, 分别命名为S₂₀ - 、S₂₂ - 、S₂₆ - 、S₂₇ - 等位基因(GenBank登录号分别为: AY250988、AY250990、AY339396、AY339397) 。冬黄、新梨一号、红皮酥和博山池的S基因型分别为S₈ S₂₀、S₈ S₂₂、S₁₂ S₂₆和S₁₉ S₂₇。     

苹果新品种自交不亲和基因型的分子生物学鉴定

根据保守氨基酸序列FTQQYQ 和anti-¹/_M IWPNV 设计苹果自交不亲和基因引物P1 : 5′2 TT2TACGCAGCAATATCAG23′; P2 : 5′2 ACGTTCGGCCAAATA /CATT23′, 利用PCR - RFLP分析方法, 以河北省新引进的苹果品种美国8号、昂林、松本锦、华冠、南方脆幼叶为试验材料, 鉴定其自交不亲和基因型分别为S₉S₂₇、S₁S₉、S₉S ₉、S₂S₉、S₂S₉。     

Diversity of S-RNase genes and S-haplotypes in Japanese plum (Prunus salicina Lindl.)

Summary

This report demonstrates the diversity of S-haplotypes in Japanese plum by molecular cloning of genomic DNAs and cDNAs that encode S-RNases. Nine different DNA fragments, designated as S^a–Sⁱ, were obtained from 17 Japanese plum cultivars by PCR with an S-RNase gene-specific primer set, Pru-C2 and PCE-R. Eleven different S-haplotypes were found in these cultivars. The banding patterns obtained with another S-RNase gene-specific primer set, Pru-T2 and PCE-R, corresponded to the S-haplotypes predicted from the Pru-C2 and PCE-R primer set. Several cultivars had the same S-haplotypes. Partial genomic DNAs for eight S-RNase genes and cDNAs for two S-RNases were cloned and sequenced. Deduced amino acid sequences contained conserved regions among the rosaceous S-RNases. Comparisons of the sequences from cDNAs and genomic DNAs revealed the presence of two introns in the S-RNase genes of Japanese plum as in other Prunus S-RNase genes. Pollination incompatibility groups and self-compatibility in Japanese plum were discussed with reference to the S-haplotypes.