柔嫩艾美耳球虫地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株的实验室诱导

采用药物浓度逐渐递增的方法 ,以 0 .0 5× 10 - 6 地克珠利和 2 .0× 10 - 6 马杜拉霉素为起始诱导浓度 ,分别经过 18次和 2 0次传代 ,在实验室诱导了柔嫩艾美耳球虫 (Eimeria tenella)对地克珠利和马杜拉霉素的抗药性虫株。经抗药性检测 ,以最适抗球虫指数 (POAA)、病变记分减少率 (RL S)、相对卵囊产量 (ROP)和抗球虫指数 (ACI) 4项指标综合判定及综合抗药性指数 (GI) 2种方法共同判定 ,获得的地克珠利抗药株对 1.2× 10 - 6地克珠利具有完全抵抗力 ,而对马杜拉霉素完全敏感 ;马杜拉霉素抗药株对 7.0× 10 - 6 的马杜拉霉素具有完全抵抗力 ,而对地克珠利完全敏感。     

地克珠利抗柔嫩艾美耳球虫凤阳地理株的效果观察

将 60只 1日龄蛋公鸡于无球虫条件下饲养至 30日龄时随机分为 5组 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组 )。Ⅰ组用地克珠利饮水 (每千克水 1mg) ;Ⅱ组地克珠利混饲 (每千克饲料 2mg) ;Ⅲ组为药物对照组 (每千克饲料克球粉 5mg) ;Ⅳ组为感染不给药 ;Ⅴ组为不感染不给药组。于给药当天 ,除Ⅴ组外 ,其他组鸡每只接种 1× 1 0 5个柔嫩艾美耳球虫凤阳地理株孢子化卵囊。根据各组鸡的存活率 ,相对增重率 ,病变记分 ,血便记分和抗球虫指数来观察药物疗效。试验结果表明 ,地克珠利能有效的控制凤阳地理株柔嫩艾美耳球虫。     

马杜霉素与地克珠利联合应用抗鸡柔嫩艾美耳球虫效果试验

鸡球虫病是严重威胁养鸡业的一种寄生原虫病。15～20日龄雏鸡发病率高，死亡率可达80％以上。目前，鸡球虫疫苗在实践中应用效果不是十分理想。因此，采用药物防治球虫病仍是控制本病的主要手段。虽然国内应用的抗球虫药物种类很多，但由于各地虫株的差异和球虫较易产生耐药性，导致球虫病的治疗效果不是十分理想。为防止球虫产生耐药性，较好的办法是定期变换或联合应用作用机理不同的药物，     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫对地克珠利敏感性试验

进行了3个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫(吉林株、山东株、黑龙江株)对地克珠利饮水剂的敏感性试验.分别给予试验组鸡1×105个孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊,感染后饮水给予地克珠利药物治疗.结果表明,3株球虫的敏感性不同,其敏感顺序为:山东株＞黑龙江株＞吉林株.由此可见,柔嫩艾美耳球虫不同地理株间存在对地克珠利的敏感性差异.     

柔嫩艾美耳球虫野外分离株对3种化学合成药物的抗药性

取近年分离的６个广东柔嫩艾美耳球虫（Ｅimeria tenella）野外株,以病变记分减少率（ＲＬＳ）和抗球虫指数（ＡＣＩ）作为判断指标,检测了它们对地克珠利、球净和球痢灵的抗药怀。结果发现,５个野外分离株对地克珠利抗药,１个敏感;６个野外分离株均对球痢灵抗药。参考株（ＧＤ株）对地克珠利、于净这２种药物仍很敏感,但对球痢灵部分抗药。     

柔嫩艾美耳球虫地克珠利耐药株与敏感株基因组SNP杂合度的比较分析

鸡球虫病是阻碍养禽业健康发展的重要寄生虫病。地克珠利作为一种低毒、广谱、高效的抗球虫药物得到了广泛使用,但长期使用导致鸡球虫耐药株广泛出现。为了探究鸡球虫对地克珠利产生耐药性的分子机制,本试验采用药物浓度递增的方法诱导耐药株,通过全基因组重测序分析柔嫩艾美耳球虫耐药株和敏感株之间单核苷酸多态性(SNP)的杂合度差异。结果显示,与敏感株相比,耐药株在蛋白激酶(EVM0000192)基因存在2个非同义突变,推测其与柔嫩艾美耳球虫的地克珠利耐药性的产生有关,本试验为后续利用更多耐药株的SNP来发掘地克珠利耐药基因提供了科学依据。     

柔嫩艾美耳球虫拉沙里菌素抗性虫株的实验室诱导

采用实验室建立抗性虫株的方法,用４０、６０、７５、１０５、１２５、１３５μｇ／ｇ梯度的拉沙里菌素作用于柔嫩艾美耳球虫盐霉素敏感株和盐霉素抗性株,经过１５次继代,诱导产生了对１３５μｇ／ｇ拉沙里菌素的抗药性虫株。在同一诱导条件下,盐霉素敏感株和盐霉素抗性株对拉沙里菌素产生抗药性的时值和强度没有差异。     

柔嫩艾美耳球虫YL株抗药性研究

用柔嫩艾美耳球虫杨凌株 ( YL t)对 1 4日龄雏鸡进行感染 ,检测了该虫株对 4种常用抗球虫药 (马杜拉霉素、地克珠利、克球粉和氯苯胍 )的敏感性。以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标 ,进行综合评定 ,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性 4个等级。结果表明 ,该虫株对马杜拉霉素有轻度抗药性 ,对地克株利有完全抗药性 ,对克球粉和氯苯胍无抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫野外分离株对3种化学合成药物的抗药性

取近年分离的 6个广东柔嫩艾美耳球虫 ( Eim eria tenella)野外株 ,以病变记分减少率 ( RLS)和抗球虫指数 ( ACI)作为判断指标 ,检测了它们对地克珠利、球净和球痢灵的抗药性。结果发现 ,5个野外分离株对地克珠利抗药 ,1个敏感 ;1个野外分离株对球净抗药 ,4个部分抗药 ,1个敏感 ;6个野外分离株均对球痢灵抗药。参考株 ( GD株 )对地克珠利、球净这 2种药物仍很敏感 ,但对球痢灵部分抗药。     

5株柔嫩艾美耳球虫对4种抗球虫药的抗药性

选择260只19日龄雏鸡，随机分成26组，每组10只，研究柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)南京株、凤阳株、扬州株、宣城株和蒙城株对地克珠利(Diclazuril)、马杜霉素(Maduramicin)、氯羟吡啶(C1opido1)、氯苯胍(Robenidine)的抗药性。每株球虫均设4个感染用药组、1个感染不用药组，另外设1个不感染不用药组。以POAA、RLS、ROP、ACI作为指标，判定5株球虫对4种药物的抗药性。结果表明凤阳株、扬州株和蒙城株分别仅对马杜霉素、氯苯胍、地克珠利敏感，南京株和宣城株对该4种药物均已产生不同程度的抗药性。提示目前在凤阳、扬州和蒙城地区可分别合理地使用马杜霉素、氯苯胍和地克珠利，对其它药物须减少或暂停使用。     

柔嫩艾美耳球虫氯嗪苯乙氰抗性株与氯羟吡啶抗性株的实验室诱导

在药物浓度递增的情况下，经过10次传代，诱导出对1．25mg/kg氯嗪苯乙氰产生抗花药性的E.tenella虫株，初始诱导浓度为0．07mg/kg；经过6次传代，诱导出对150mg/kg氯羟吡啶产生抗药性的E.tenella虫株，初始诱导浓度为75mg/kg，低浓度（0．125mg/kg)氯嗪苯乙氰即具有高效抗球虫作用，在诱导过程中，E.tenella一旦对浓度（0．07mg/kg,0.125mg/kg)氯嗪苯乙氰产生了较为稳定的抗药性，诱导过程便进行得很快，一步一个台阶，即于虫的抗药性突破某一阈值后容易对高一级浓度的药物产生抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫耐药株与鸡3种球虫的同工酶的研究

对不同离子载体抗生素具有抗药性的柔嫩艾美耳球虫和药物敏感的柔嫩区美耳球虫、布氏匀美耳球虫和堆型艾耳球虫的孢子化卵囊,采用聚安凝胶垂直板电泳,进行了乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）、葡萄糖磷酸异构酶（ＧＰＩ）和葡萄糖－６－磷酸脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）等同工酶华不同离子载体抗生素具有抗药性的柔嫩艾美耳球虫和药物同工酶酶谱可以反应出球虫种间差异;而柔嫩艾耳球虫抗性虫株的ＬＤＨ酶谱是２条带,敏感虫株是３条带,抗性株比敏感株     

柔嫩艾美耳球虫抗药性相关基因M20的克隆与表达

利用前期构建的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株与各自母株之间的抑制性消减文库而获得的ESTs序列,选择其中一个差异表达的EST序列（克隆号为M20）,采用RACE技术,以柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊cDNA为模板,扩增获得了该基因的全长cDNA序列,命名为M20,该基因全长847 bp,包括一个525 bp的开放阅读框,编码174个氨基酸,预测理论分子量约为19 ku。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在敏感株中表达量高于地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株;在不同发育阶段中,未孢子化卵囊表达量高于孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子阶段虫体。将该基因克隆于原核表达质粒pET28b中,构建重组质粒pET28b-M20,转化大肠杆菌BL21（DE3）后,经IPTG诱导表达获得了重组蛋白,分子量约约为23 ku,该蛋白以包涵体形式存在,在IPTG诱导8 h后表达稳定,Western blot检测表明,其具有较好的免疫原性。     

杀球灵对柔嫩艾美耳球虫作用的研究

本文报道了杀球灵(Diclazuril)对鸡柔嫩艾美耳球虫E.tenella的杀灭作用、作用峰期及停药后作用持续时间。以1ppm的推荐剂量混于饲料,分别于感染前2天、感染当天、感染后1天开始饲喂,对经口一次人工感染8×10~4/只柔嫩艾美耳球虫卵囊的鸡有显著的保护作用。试验鸡不出现血便、盲肠组织学检查及粘膜刮取物镜检均不见合子及卵囊,感染后2天给药则其抗球虫作用显著降低。故可认为杀球灵作用峰期是子孢子和第一代裂殖体阶段。停药后其抗球虫作用很快减弱或消失。     

不同给药方案对鸡现场球虫免疫的影响

20日龄海赛克斯雏鸡连续50余天经垫料自然免疫接种一定量的球虫卵囊,同时采用不同的给药方案,饲喂含抗球虫药的饲料,72日龄时用大剂量卵囊(8×10~4)攻击。根据试验鸡的增重、盲肠病变评分和盲肠卵囊数等指标,评定不同给药方案对鸡球虫免疫的影响。结果表明:单独使用作用于球虫生活史早期的聚醚类离子载体抗生素,会严重抑制鸡对球虫的免疫力。聚醚类离子载体抗生素与作用于球虫生活史后期的化学合成药联合用药或低剂量配合用药,则对免疫无影响。     

柔嫩艾美尔球虫和巨形艾美尔球虫的分离与鉴定

采用单卵囊分离技术，获得了两纯种球虫，鉴定为柔嫩艾美尔球虫（Ｅｉｍｅｒｉａｔｅｎｅｌａ）和巨形艾美尔球虫（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）。主要鉴定指标：柔嫩艾美尔球虫，虫体寄生于鸡盲肠，卵囊呈卵圆形或宽卵圆形，有极体，无内、外残余体，测２００个卵囊的平均大小为（２０１６±１６１）×（１５５９±１１３）μｍ，测２００个孢子囊的平均大小为（１１６４±０８５）×（５．８６±０．５９）μｍ，潜隐期１４１ｈ，最短孢子化时间１９ｈ；巨形艾美尔球虫，虫体主要寄生于小肠中段，卵囊大，呈卵圆形，金黄色，有极体，无内、外残余体，测２００个卵囊的平均大小为（２８５１±１９８）×（２１．７９±１．５０）μｍ，测２００个孢子囊的平均大小为（１６３１±１０４）×（７．７８±０．４９）μｍ，潜隐期１２４ｈ，最短孢子化时间３２ｈ。     

马杜霉素抗药性诱导的实验研究

以一株对莫能菌素敏感和一株对莫能菌素抗性的柔嫩艾美耳球虫为材料，进行了马杜霉素抗药性诱导实验的研究。通过高、低两个药浓度系列的诱导，虫株经鸡体内传代１８次后，均对５ｐｐｍ和７ｐｐｍ马杜霉素产生了抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

安徽3个地区柔嫩艾美耳球虫对6种药物的抗药性

目的检测三株柔嫩艾美耳球虫对六种药物的耐药性,为防治球虫病制定临床用药方案提供依据。方法鸡体实验法检测巢湖、六安、肥东三株柔嫩艾美耳球虫对马杜拉霉素、盐霉素、莫能菌素、磺胺喹嗯啉钠、地克珠利、妥曲珠利的耐药性,以抗球虫指数（ACI）、病变记分减少率（RLS）、相对盲肠卵囊产量（ROP）和最适抗球虫活性百分率（POAA）四项指标综合判定。结果巢湖株对地克珠利,盐霉素与莫能菌素轻度耐药,对马杜拉霉素中度耐药,对托曲株利和磺胺喹嗯啉钠重度耐药,六安株对地克株利与托曲株利重度耐药,对磺胺喹嗯啉钠中度耐药,对盐霉素轻度耐药,对马杜霉素敏感,肥东株对磺胺喹嗯啉钠完全耐药,对莫能菌素重度耐药,对马杜霉素与盐霉素轻度耐药,对地克珠利与托曲珠利中度耐药。结论3个地区的柔嫩艾美耳球虫对供试药物已产生不同程度的耐药性。     

柔嫩艾美耳球虫早熟株免疫剂量研究

为了确定柔嫩艾美耳球虫（Eimenatenella）早熟株合适的免疫剂量,本文设立7个早熟株免疫攻虫组、1个不免疫攻虫组和1个不免疫不攻虫组,免疫组的免疫剂量为孢子化卵囊100、200、400、600、800、1000和2000个／羽,经嗉囊感染,7日龄首次免疫,14日龄以同等剂量进行第二次免疫,21日龄以8×10^4个／羽的同源母株进行攻虫,28日龄结束试验,以存活率、增重、肠道病变记分、血便数量、卵囊减少率为观测指标。对免疫保护效果较好的3个免疫剂量进行重复试验,同时设置商品化球虫疫苗对照组,免疫方法、试验周期、试验指标同第一批试验。结果显示：攻虫后,不免疫攻虫组出现5％死亡,而各免疫组来出现死亡;各免疫组卵囊减少率在61．57％～69．52％;200～2000免疫组的增重与不免疫不攻虫组差异不具备显著统计学意义（P〉0．05）;600～2000免疫组的肠道病变记分和血便数量均明显少于不免疫攻虫组（P〈0．05）。用600、800和1000进行重复试验,三个免疫组攻虫期间均来出现死亡,而不免疫组和疫苗对照组均出现5％死亡;三个免疫组的增重均明显高于不免疫攻虫组和疫苗对照组（P〈0．05）;早熟株免疫组的肠道病变记分和血便数量明显低于不免疫攻虫组（P〈0．05）,而疫苗对照组与不免疫攻虫组的相当（P〉0．05）;卵囊减少率在66.30％-78．75％,高于疫苗对照组的51．82％。结果表明,该柔嫩艾美耳球虫早熟株保持了良好的免疫原性,不同免疫剂量均能诱发鸡产生免疫保护力,其中600、800和1000个／羽的免疫效果均优于疫苗对照组,可考虑以600个／羽作为该早熟株在疫苗制备中的推荐免疫剂量。