乳酸乳球菌L239液体培养基的营养条件优化

为了提高乳酸乳球菌的生物量,以MRS液体培养基为基础,通过单因素试验方法与正交试验设计,对L239菌株液体培养基的营养条件进行了优化。结果表明:培养基最佳营养条件为1.0%葡萄糖、5.0%糖蜜、5.0%豆粕、0.38%硫酸铵、0.4%无水磷酸氢二钠、0.1%无水乙酸钠、0.05%柠檬酸氢铵、0.04%七水合硫酸镁、0.002 5%一水合硫酸锰、0.1%吐温,接种量为5%,初始p H值为7.0,培养温度为32℃。优化后的OD600值提高了6.8倍,且大大降低了乳酸乳球菌L239培养基的原料成本。     

表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌微胶囊制备工艺的优化

为使重组乳酸乳球菌在发酵生产后便于存储、运输,本试验利用可表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363制备微胶囊,优化微胶囊的制备工艺条件,并对胶囊化后重组菌的相关生物学特性进行检测。通过对不同壁材及壁材浓度进行控制单一变量试验,测定其包埋量,以筛选出最佳壁材及浓度。通过模拟胃肠液环境试验,比较微胶囊释放率,并对不同壁材进行保存期试验,比较最低活菌数,利用响应面试验确定最佳工艺条件,使用最佳工艺条件制备微胶囊后进行验证。优化后的结果为:选取海藻酸钠和壳聚糖作为壁材,在海藻酸钠浓度为2.49%,壳聚糖浓度为0.96%,CaCl₂浓度为6.67%,凝固时间为57 min的条件下微胶囊效果最佳,预测包埋量为7.85×10⁸ CFU/g。微胶囊在模拟胃液中稳定存在,在模拟肠液中可完全破裂,能释放出微胶囊内95%以上的乳酸乳球菌。海藻酸钠-壳聚糖微胶囊在4 ℃保存3周后,微胶囊中活菌数为1.41×10⁷ CFU/g。对微胶囊的最佳工艺条件验证结果为微胶囊的包埋量为8.08×10⁸ CFU/g;常温保存2周后,活菌数仍可达到3.89×10⁶ CFU/g;ELISA方法检测微胶囊内重组乳酸乳球菌可见表达的牛乳铁蛋白肽,抑菌试验可见微胶囊内重组乳酸乳球菌表达的牛乳铁蛋白肽对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌仍具有明显的抑制作用。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌可制备成为低成本、保存期长、耐胃液的微胶囊,为重组乳酸菌在生产中的进一步应用奠定基础。     

一株重组乳酸乳球菌菌株抗氧化能力的研究

本试验通过测定表达外源谷氨酰胺转胺酶(MTG)的重组乳酸乳球菌与其野生型的抗过氧化氢能力、氧自由基清除能力,及MTG与重组菌株抗氧化能力获得之间的关系,力图揭示重组乳酸乳球菌菌株的抗氧化机制。以期通过有氧代谢方式来提高乳酸乳球菌细胞数量,为拓宽乳酸乳球菌的工业应用领域提供新的思路。     

影响德氏乳杆菌乳酸亚种H+-ATPase活性的因素

通过测定四株德氏乳杆茵乳酸亚种H+-ATPase的活性,确定反应温度、pH值、底物添加量、培养时间以及金属离子对酶活性的影响.实验结果表明,德氏乳杆菌乳酸亚种H+-ATPase的最适反应条件为:温度42℃;pH 7.5;ATP添加量为3 mmol/L;茵株最适培养时间为8 h和24 h.Mg2+、Na+、K+对四株茵的H+-ATPase活性均有促进作用,Mn2+、Ba2+、Al3+、Li+对这4株茵的H+-ATPase活性有不同程度的抑制作用,其中Mg2+的促进作用最明显,而Al3+的抑制作用最明显.     

传统乳制品中-产细菌素乳酸乳球菌的筛选

采用平板挖井扩散法对从内蒙古传统乳制品中分离鉴定的34株乳酸菌的细菌素产生特性进行研究。在排除有机酸和过氧化氢的干扰后发现，一株乳酸乳球菌CB20—2的发酵上清液对革兰氏阳性60乳酸菌和非乳酸菌显示出抑菌活性，但对革兰氏阴性菌无抑菌作用。其蛋白特性及广谱抑菌性表明乳酸乳球菌CB20—2产生的抗菌物质是一种细菌素。     

两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中的共表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。     

乳酸乳球菌高效电转化方法的建立

以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactisNZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明：在固定电阻200Q、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2mm规格的电击杯,加入浓度为1．2μg／μL的质粒,在电场强度和脉）中时间分别为10kV／cm和5ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2h后涂板计数,转化效率最高可以达到2．6×10^4CFU／μgDNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。     

鸡源乳酸乳球菌的分离鉴定与抑菌实验

为了获得无耐药性、无毒副作用的生物药物,减少抗生素的使用,将健康肉鸡肠道进行细菌分离鉴定及体外抑菌试验,结果得知:分离菌在MRS培养基上产生明显的溶钙圈,革兰氏染色阳性,呈圆形或卵圆形;发酵分解乳糖、甘露醇等糖类,H2S、V-P等试验为阴性,MR为阳性;在约1 400bp处出现目的条带,测序比对结果,分离菌与乳酸乳球菌同源性最高;该菌对阿奇霉素、红霉素等高敏,对头孢曲松、环丙沙星中敏,对诺氟沙星、四环素耐药;分离菌对病原指示菌均有抑制作用,其中对葡萄球菌、嗜水气单胞菌尤为显著;试验小白鼠均健康生长,无不良反应。结论:分离菌为乳酸乳球菌,具有广谱抑菌作用,可作为益生菌取代或减少抗生素的使用。     

纤维二糖水解酶在乳酸乳球菌中的表达

为在乳酸乳球菌中表达纤维二糖水解酶II(CBH II)基因,对绿色木霉(T.reesei)CBH II基因序列进行密码子优化和合成,通过PCR及T4 DNA连接酶将人工合成的序列插入到表达载体pNZ8148中,获得重组质粒pNZ8148-CBH II,重组质粒经双酶切及测序鉴定正确后,将正确的重组质粒通过电击转化进入乳酸菌NZ3900感受态细胞,通过选择性抗生素氯霉素筛选阳性克隆,放大培养后使用终浓度为20 ng/mL的Nisin进行诱导表达,诱导后的菌液经SDS-PAGE鉴定,有符合预期大小的条带,说明CBH II基因在乳酸乳球菌NZ3900中表达。研究为乳酸乳球菌的改造及开发临床应用奠定基础。     

液芯包囊化清酒乳杆菌增殖培养基的优化

通过单因素实验确定包囊化清酒乳杆菌的最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨,最佳促生长因子为番茄汁,pH缓冲剂CaCO3最佳浓度为0.5%。在此基础上,采用响应曲面法建立了菌体浓度多元二次模型方程,探讨了4个因子的交互作用及其最佳水平范围,得到最佳培养基组成为:乳清粉60g/L,葡萄糖18.87g/L,蛋白胨21.98g/L,番茄汁98.62mL/L,CaCO34.39g/L,MgSO40.28g/L,MnSO40.18g/L。     

亚硝基胍诱变选育丁二酮高产菌株

以乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种为出发菌株，采用亚硝基胍进行诱变选育，得到高产丁二酮菌株，用邻苯二胺比色法检测突变株丁二酮，其产量达到0．72mg／L，比出发菌株产量0．056mg/L提高12．9倍，且遗传性质稳定。     

猪脂联素球状结构域gAd基因在乳酸乳球菌中的表达

本研究旨在克隆猪脂联素球状结构域gAd基因,构建重组质粒并将其转化至乳酸乳球菌NZ9000中进行表达,并在体外对重组猪脂联素球状结构域进行生物学活性分析。提取猪脂肪组织总RNA,扩增得到脂联素基因全长并测序,设计引物引入酶切位点和His-tag,把gAd亚克隆到表达载体pNZ8048,将重组质粒转化乳酸乳球菌NZ9000中诱导表达。通过Ni 2+亲和层析柱对重组蛋白纯化后再Western blotting检测。然后,将gAd蛋白注射到高糖饲喂的小鼠体内鉴定生物学活性。结果表明成功获得了gAd基因并在乳酸乳球菌NZ9000中表达,表达产物相对分子质量约17ku。经纯化后用Western blotting检验具有反应原性,动物试验证明制备的gAd蛋白能显著降低小鼠的血糖水平。本研究为利用外源重组脂联素球状结构域调节猪的脂肪代谢打下了良好的基础。     

乳酸乳球菌和魏斯氏菌的分离及鉴定

试验以生牛奶、自制泡菜水、青贮料、市售奶酪为样品,进行乳酸乳球菌和魏斯氏菌的筛选与鉴定。通过培养基中菌落形态观察和镜检细胞形态观察,共筛得6株疑似乳酸球菌（分别命名为ST1、ST2、ST6、ST7、ST8、ST9）。经生理生化、耐盐性、耐热性试验以及16S rD-NA序列分析鉴定,这6株菌分属两个属：ST1、ST2、ST7、ST9为乳酸乳球菌（Lactococcus lac-tis）,其中ST2为乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp. Cremoris）,ST7为乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactis subsp. Lactis ）;ST6、ST8属于魏斯氏菌属（Weissella）,其中ST6为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。研究表明,生牛奶和泡菜水分别是乳酸乳球菌和魏斯氏菌的优良生活环境,传统方法与分子生物技术相结合可更准确快速地分离及鉴定菌株。     

幽门螺旋杆菌lpp20-cagA融合基因在乳酸球菌中的表达及免疫原性研究

为研究载体疫苗对幽门螺旋杆菌(HP)感染的免疫保护作用,本实验应用无缝克隆技术将HP的两个候选抗原基因lpp20和cagA直接连接后克隆于表达载体pNZ8149中,构建重组表达质粒pNZ8149-lpp20-cagA。将重组质粒电转化乳酸球菌(L.lactis)NZ3900,构建了不含任何抗生素筛选标记的食品级原核表达系统pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900,经nisin诱导表达,得到的重组蛋白分子量约为50.3ku。将以上得到的重组L.lactis灌胃免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法分别检测各组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4、IFN-γ水平。结果显示,与对照组相比,实验组小鼠血清中IgG、IgG1、IL-4水平显著升高,表明重组蛋白Lpp20-CagA可以诱导良好的体液免疫应答;利用HP攻毒经重组菌灌胃免疫的小鼠,检测小鼠胃组织中HP的定植密度及脲酶活性,结果显示重组蛋白Lpp20-CagA在一定程度上可以减少HP在小鼠胃组织中的定植。本实验构建的载体疫苗在预防HP感染方面具有重要的应用价值。     

柔嫩艾美耳球虫TA4抗原基因cDNA在乳酸乳球菌中的克隆与表达

用PCR技术特异扩增了柔嫩史美耳球虫TA4抗原基因cDNA序列，克隆至质粒pMD18-T中，获得重组质粒pMD18-T-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及PCR确认正确后，将TA4基NcDNA目的片段亚克隆到乳酸乳球菌表达载体pMG36n中，电穿孔法转化乳酸乳球菌LM0230，获得重组质粒pMG36n-TA4，采用KpnⅠ／SacⅠ双酶切法及DNA测序证明cDNA序列完全正确。获得TA4乳酸乳球菌表达株，经SDS—PAGE电泳分析，结果表明表达产物与预期大小的TA4蛋白分子量一致。     

Lactobacillus fermentum F6的增殖培养基优化及高密度发酵的研究

对分离自少数民族传统乳制品中的Lactobacillus fermentum F6菌种的增殖培养基进行优化,并对其高密度发酵条件进行探索。通过测定不同组成培养基中菌体在600nm波长下的光密度和发酵液在不同发酵条件下的活菌数,得到最适增殖培养基配方及其高密度发酵条件。增殖培养基配方为:蔗糖62.0g/L、酵母粉35.5g/L、大豆蛋白胨12.0g/L、柠檬酸1.35g/L、柠檬酸钠22g/L、MgSO4·7H2O2g/L、MnSO4·5H2O100mg/L、Tween-801g/L。在5L发酵罐中,Lactobacillus fermentum F6经优化发酵条件,其活菌数可达到2.30×1010CFU/mL,加入保护剂经冷冻干燥后活菌数可达到1.45×1011CFU/g,存活率为79.11%。中试培养液中活菌数可达1.02×1010CFU/mL,存活率为58%。以上优化的增殖培养基和高密度发酵条件为Lactobacillus fermentum F6的工业化生产奠定了基础。     

山羊支原体山羊肺炎亚种培养基的筛选及生长曲线测定

为筛选出山羊支原体山羊肺炎亚种的适宜培养基,将山羊支原体山羊肺炎亚种分离株M1601分别接种Thiaucourt肉汤、MEM-KM2和TSA 3种不同的培养基,测定其在3种不同培养基中生长滴度、生长速度,并测定了M1601在最适培养基中在不同培养阶段的生长滴度。结果表明,添加2g/L丙酮酸钠和150mL/L马血清的Thiaucourt肉汤培养基最适宜山羊支原体山羊肺炎亚种的生长,生长滴度可达109 CCU/mL,在培养6h后开始进入对数生长期,培养60h后进入稳定期,培养72h时后进入衰亡期。此试验结果为山羊支原体山羊肺炎亚种培养特性研究提供了参考数据。     

不同增菌液和培养基对沙门菌分离效果的比较研究

通过对各种增菌液和培养基的比较以及组合筛选,选择一种较为有效和简便的分离沙门菌的方法.采用6种常用的选择性培养基对9种血清型的沙门菌以及常见的共生肠道菌大肠杆菌和阴沟肠杆菌分别进行培养,根据生长特点对选择性培养基进行初步筛选,然后对3种常用选择性增菌液进行筛选,将筛选出的增菌液与培养基进行不同组合,检测各血清型沙门菌与大肠杆菌、阴沟肠杆菌的混合物在不同组合中的增菌和分离效果,并对其进行评价.研究结果表明,最佳分离培养方案为样品经SC和TTB增菌后再用显色培养基或者XLT4培养基进行选择性培养.本研究结果优化了沙门菌的常规分离培养方法,可用于不同样品中沙门菌的分离培养,提高沙门菌分离率.