新疆棉花黄萎病菌营养体亲和性的量化评估及其营养体亲和？…

从１６个采自新疆不同棉共的棉花黄萎病菌（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）菌株和３个落叶型与非落叶型对照菌株上共获得２２５个不能利用硝酸盐的营养体突变株（ｎｉｔ ｍｕｔａｎｔｓ）。经不同氮源利用的鉴定,８９．３３％属于ｎｉｔＡ．９．３３％属于ｎｉｔＢ,１．３３％属于ｎｉｔＣ,其中ｎｉｔＣ在以ＮａＮＯ２作为唯一一氮源的ＭＯ２培养基上被完全抑制致死。ｎｉｔＡ配ｎｉｔＢ的营养体亲和性测定结果,１     

棉花黄萎病菌单克隆抗体的制备

应用常规PAGE技术将棉花黄萎病菌落叶型菌系VD-8与棉花上其他常见的病原真菌进行分析对比,切下VD-8的两条特异性蛋白条带进行回收,以此作为抗原免疫BALB/C小鼠,制备VD-8菌系的单克隆抗体.通过细胞融合,阳性杂交瘤细胞的筛选及有限稀释法的细胞克隆化步骤,应用间接ELISA检测方法获得了5株OD值高的单克隆细胞株.经扩大化培养后取上清液对棉花上的常见病原真菌及黄萎菌的其他若干菌系进行鉴定,结果表明所制得的单抗基本上能将棉花黄萎病菌鉴定到种,但存在一定的交叉反应.     

棉花黄萎病内生拮抗细菌的分离及LC-04菌株的鉴定

从棉花根、茎、叶部组织中分离到19株对棉花黄萎病菌大丽轮枝菌有枯抗作用的细菌,其中抑菌圈直径大于20mm的菌株1株.直径10～20mm之间的菌株5株,直径小于10mm的菌株13株.分离自棉花叶部组织的LC-04菌株对大丽轮枝菌V-190菌株生长的抑制作用最强.通过时LC-04菌株菌体形态、菌落特征的观察和一系列生理生化试验分析,该菌株鉴定为类芽孢杆菌属细菌.     

我国棉花黄萎病菌群体的遗传变异分析

对源于我国主要棉区的24个棉花大丽轮枝菌株,美国的T9和一个从茄子植株上分离的大丽轮枝菌株进行了性状培养观察、致病性测定及遗传多样性分析。结果表明,用中选的25个随机引物对26个菌株进行RAPD-PCR扩增,产生379条DNA带,其中223条为多态性带;对26个菌株的RAPD指纹图谱聚类分析可将其分为8大类,聚类结果与其地理来源相关性不大,而与菌株的致病性程度有很大的相关性;落叶型和非落叶型菌株的遗传基础差异很大。通过不同菌株对棉花品种的田间接种试验,依其致病程度区分,结果与RAPD指纹图谱聚类的结果基本吻合。     

棉花黄萎病菌激发子对棉花黄萎病的诱抗作用

用不同毒力的大丽轮枝菌菌丝胞壁激发子分别直接诱导不同抗性的棉花品种,结果表明,棉花过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性与植物保卫素棉酚的含量经病原菌激发子诱导后都有不同程度的提高,并就其对病菌毒素的降解作用进行了初步研究.     

棉花黄萎病

1.病害诊断棉花黄萎病是由大丽轮枝菌感染引起的维管束病害,被称为"棉花的癌症"。病叶边缘稍向上卷曲,叶脉间产生淡黄色不规则的斑块,叶脉附近仍保持绿色,呈掌状花斑,类似花西瓜皮状;有时叶片叶脉间出现紫红色失水萎蔫不规则的斑块,斑块逐渐扩大,变成褐色枯斑,甚至整个叶片枯焦,脱落成光秆;劈开茎秆或叶柄,可见维管束变黄褐色。     

利用拮抗细菌防治棉花黄萎病

从棉花根围和根内分离到17个供试菌株在平板对峙培养中，都能极显著抑制Verticillium dahliae Kleb(简称Vd）的生长，其中15株的抑菌率大于65％，最高达89．6％。这些菌株的培养滤液也对Vd的生长有抑制作用。对供试细菌的防病及棉花出苗安全性所作的盆栽试验结果表明，13个菌株对棉花出苗表现安全；10个菌株防治棉花黄萎病效果极显著，其中4株（ICB－18、NCD－2、CS－25和CS－27）的防治效果达72．3％0－81．4％；3株（C－94、C－28和NCD－25）的防治效果鬃55．7％－61．9％，而且这7株对棉花出苗都安全。田间试验结果表明，在这7个菌株中，菌株NCD－2能够极显著地防治棉花黄萎病，防治效果为78．1％；另外4株（ICB－18、CS－25、C－94和C－28）能显著降低黄萎病病情指数，防治效果达37．1％－47．3％。     

棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能验证及致病成因分析

为分析棉花黄萎病菌VdTri15基因的功能,利用基因同源重组原理将强致病力落叶型大丽轮枝菌Vd991菌株的VdTri15基因进行敲除。以Vd991菌株为对照,比较分析敲除突变体与野生型之间在生长速度、外分泌毒素、致病性等方面的差异,探讨VdTri15基因在致病过程中的功能。结果表明,VdTri15突变并不影响病菌的生长,但可引起其致病力减弱,分泌毒素种类发生改变。由此说明,VdTri15基因通过影响相关毒素的合成来影响大丽轮枝菌的致病力。     

分离自棉花的轮枝菌“种”的鉴定

【目的】已知引起植物萎蔫病的轮枝菌有5个“种”,本研究旨在澄清在中国引起棉花黄萎病的轮枝菌的“种”类。【方法】从中国12个省84个县分离获得310个轮枝菌菌株,采用生物学性状观察和分子鉴定相结合的方法,对其进行“种”的鉴定。【结果】298株均产生黑色微菌核和轮枝状分生孢子梗,为典型的大丽轮枝菌,另有12个菌株培养性状较为特殊（不产生微菌核,出现黑色菌丝或厚壁孢子）,经温度敏感试验、PCR特异扩增及ITS序列进一步鉴定,2株被确定为变黑轮枝菌,其它10株被确定为大丽轮枝菌,没有出现黑白轮枝菌。【结论】在中国三大棉区,棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的。但在长江流域和黄河流域棉区均分离到1株变黑轮枝菌,其在棉花黄萎病发生过程中的作用及其与大丽轮枝菌的互作还有待进一步研究。     

助剂激健在防治棉花黄萎病中的效果

目的 优化生产上常用的杀菌剂、诱抗剂和助剂的组方,综合评估助剂激健对大丽轮枝菌V991防治显著增效的杀菌剂及施用方法,为棉花黄萎病防治中化学农药的减施增效提供技术支持。方法 用药/激健,生药/激健组合对V991菌丝进行菌丝生长速率实验,筛选出激健对V991菌丝显著增效的杀菌剂,通过盆栽黄萎病防治实验,分析诱抗剂、药/激健的施用措施和方法。结果 激健可作为增效剂,可增加多菌灵、乙蒜素对V991菌丝生长的抑菌率,添加激健后,50 mg/kg多菌灵与5 mg/kg乙蒜素的菌丝生长抑菌率也分别由19.68%提高至35.49%和14.83%提高至26.29%,并且添加激健后,多菌灵与乙蒜素的EC₅₀也分别由1.707 mg/kg降低至0.104 mg/kg和1.249 mg/kg降低至0.824 mg/kg,其药剂施用量也相应地降低了16.41和1.52倍,接菌前或接菌后施用诱抗剂,配合多菌灵/激健-乙蒜素/激健组合顺序施药的方式防治效果最好,其28 d后的防治效果仍可高达69.27%和62.70%。结论 激健可作为棉花黄萎病防治中的多菌灵、乙蒜素的增效剂,明显降低对大丽轮枝菌菌丝抑制的药剂施用量,盆栽黄萎病防病时,无论在接菌前或接菌后施用氨基寡糖素,并采用多菌灵/激健-乙蒜素/激健顺序施药组合均对棉花黄萎病防治效果最佳。     

茄子黄萎病病原菌鉴定

从乌鲁木齐地区和北疆部分地区茄子黄萎病株上分离到的49个菌株,均产生微菌核,菌丝在30℃均可生长,而在33℃不能生长,经鉴定均为轮枝孢属大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)。对其中11个菌株进行的致病力测定表明,各菌株间的致病力无显著差异,均属致病力较轻类型。     

芽孢杆菌HT-7对棉花黄萎病菌的拮抗 作用及拮抗因子初探

为获取安全、高效、可持续性的棉花黄萎病生防资源,并探究其主要的拮抗因子,从而有效开展棉花黄萎病的绿色防控,从黄萎病抗性棉(海7124)根系土壤中分离得到1株对棉花黄萎病具有良好防治效果的菌株Bacillus sp.HT-7,采用平板对峙法和盆栽试验探究拮抗菌株的抗病能力,并以硫酸铵盐析及基因克隆的方法探究拮抗因子,进行抗菌验证。对峙试验结果表明,菌株HT-7对棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌的抑菌率达56%;盆栽试验结果表明,菌株HT-7可以显著提高陆地棉对黄萎病的抗性。与对照组(未采用菌株HT-7进行土壤处理)相比,采用菌株HT-7进行土壤处理的棉花伤根接种大丽轮枝菌后对黄萎病的防治效果高达82.58%。进一步研究发现,HT-7发酵液可以显著抑制大丽轮枝菌孢子萌发,经鉴定可知,菌株HT-7的主要拮抗因子是蛋白质类物质β-1,3-1,4-葡聚糖酶。从该菌株中克隆得到β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因,并将其在E.coli BL21中进行高效表达,纯化的重组酶活性为23.5 U/mL,重组酶能明显抑制大丽轮枝菌的生长,抑菌率达25%。综上,成功分离出1株拮抗芽孢杆菌HT-7,并确定β-1,3-1,4-葡聚糖酶是HT-7拮抗菌的一个重要毒力因子。     

江苏省大丰市棉花黄萎病菌培养特性及致病力分化

对2008年至2009年采自江苏省大丰市植棉区的22个棉花黄萎病菌菌株进行了培养特性及致病力分化方面的研究.依据在PDA培养基上生长时形成微菌核的数量,将菌株分为3种培养类型,其中菌核型占86.4％,菌丝型占9.1％,中间型占4.5％.采用已报道的落叶型与非落叶型的特异性引物对上述菌株进行致病类型的检测发现,落叶型菌株占81.8％,非落叶型菌株仅占18.2％.苗期致病力测定表明大丰市植棉区的棉花黄萎病菌存在明显的致病力分化,甚至在同一田块所分离的菌株也存在致病力的差异分化.     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Verticillium dahliae）中一个新基因（VdHP1）的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因（VdCrz1、VdNoxB、VdPls1）、分泌蛋白释放相关基因（VdSep5）及分生孢子产生相关基因（Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2）在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因（VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1）在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

大丽轮枝菌弱致病力菌株Vd171对棉花黄萎病的诱导免疫作用及机制

【目的】明确大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）弱致病力菌株Vd171对棉花黄萎病的诱导免疫效果及作用机制, 为探索棉花黄萎病生物防治新途径提供依据。【方法】以大丽轮枝菌弱致病力菌株Vd171为研究对象,温室苗期评估不同接种方法、接种时期、接种次数及接种体类型的诱导免疫效果;不同接种方法包括蘸根、灌根、茎部针刺、叶面喷雾和浸种,均采用Vd171分生孢子悬浮液（1×10⁷个分生孢子/mL）,蘸根、灌根和叶面喷雾为每钵10 mL,茎部针刺为每株0.2 mL,浸种时间为12 h;不同接种时期试验设置接种棉花黄萎病菌强致病力菌株Vd080前2、4、6、8 d及之后的1、2、4 d接种Vd171共7个处理;接种次数试验设置接种Vd080前接种Vd171 一次和两次;接种体类型采用Vd171的分生孢子悬浮液和查氏培养滤液。采用水培方法培育棉苗,先接种Vd171,4 d后接种Vd080GFP,不同时间取根组织,振荡冲洗Vd080GFP分生孢子,显微镜下计数,测定弱致病力菌株免疫后病原菌在棉苗根部的定殖量;接种Vd080GFP后第7天,PDA平板上分离棉苗下胚轴切段,检测病原菌在植株体内的扩展速度。取接种Vd171后不同时段的棉苗,采用qPCR方法检测植株内防御相关酶基因4CL、CHI、POD、PPO和PAL的表达量;测定POD、PPO、PAL和CHI的活性变化。将棉苗茎部做切片,用间苯三酚染色,显微镜下观察茎部维管束木质化情况;将棉苗叶片用DAB染色,观察叶片活性氧爆发情况。【结果】在接种大丽轮枝菌强致病力菌株Vd080前4 d接种Vd171,棉株的免疫效果最好,防治效果达到89.4%;几种接种方法相比较,以蘸根防治效果最好,为70.0%,其次是叶面喷雾,为54.3%,浸种和灌根分别为45.0%和39.0%,而针刺效果最差,为2.2%;接种Vd171一次和两次对棉株均具有较好的免疫效果,其防治效果分别为85.6%和81.4%;先接种分生孢子、培养滤液对棉株均具有较好的免疫效果,其防治效果分别为85.6%和81.1%;先接种Vd171能阻止Vd080在棉花根部的定殖和在植株体内的扩展;Vd171能显著诱导棉苗防御相关基因PAL、4CL和CHI的表达,其中,GhPAL、Gh4CL和GhCHI变化最大,分别为对照处理的2.2、8.5和2.6倍,均显著或极显著高于对照;经Vd171诱导的棉苗下胚轴中PPO、PAL、POD和CHI酶活性均极显著高于对照,分别较对照提高31.9%、131.0%、57.1%和102.1%,子叶中PAL、CHI和POD酶活性也显著高于对照,分别较对照提高22.1%、39.6%和7.1%,PPO酶活性与对照无显著差异;先接种Vd171诱导了细胞木质化和活性氧的爆发。【结论】大丽轮枝菌弱致病力菌株Vd171可以有效地诱导棉花对黄萎病产生抗性,在棉花黄萎病防治上具有较好的应用前景。     

紫荆黄萎病病原菌研究

在紫荆树上发现1种紫荆新病害 紫荆黄萎病,病叶症状有2种类型：一种为灰绿色干枯型,主要表现为叶片从边缘开始失水萎蔫,逐渐向叶片中心扩展,后期整个叶片皱缩卷曲、质地较脆,呈现灰绿色焦枯状;另一种为黄色萎蔫型,前期叶片从边缘开始变黄萎蔫,逐渐向内部扩展,病健交界处有明显界限,后期叶片皱缩,颜色呈现淡黄色到淡橘黄色。发病枝条的维管束呈浅橘红色或褐色,病叶不脱落。依据Koch’s准则证明,分离物CC001是引起该病害的病原菌。对CC001菌株的rDNA ITS区段进行PCR扩增和测序,并结合形态学特征鉴定为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）。寄主范围测定结果表明,该病菌还可以侵染马铃薯和棉花。该研究是国内关于紫荆黄萎病的首次报道。     

新疆棉花黄萎病发生调查及病原菌系统进化分析

[目的]调查新疆主要植棉地区棉花黄萎病发生情况,对新疆棉花黄萎病菌系系统进化及落叶型菌系分布进行分析和检测.[方法]抽样调查棉花黄萎病发病情况,利用Verticillium dahliae特异性引物D1/D2进行落叶型检测;利用真菌通用引物ITS1和ITS4对新疆菌系进行扩增,测序后进行BLASTN分析.[结果]棉花黄萎病在新疆主要植棉地区普遍发生,棉花黄萎病发生中度及以上病田占比达48.1;,严重发生病田占比为24.1;;BLASTN分析证实采集的棉花黄萎病菌系均为大丽轮枝菌;供试棉花黄萎病菌系检测出22株落叶型菌系,占供试菌系的37.2;.在分离到棉花黄萎病菌系的15个采集点中有9个点检测到了落叶型菌系,占比为60.0;.[结论]新疆部分棉区棉花黄萎病发生比较严重,强致病力的棉花黄萎病落叶型菌系在新疆呈现逐年增加的趋势,且地理分布较广.     

大丽轮枝菌在棉花品种上的致病力分化研究

通过１９个大丽轮枝菌菌株对１６个品种的抗、感反应,可以将大丽轮枝苗 发为落叶型和非常叶型两个基本类群。在落叶型类群中,根据８个落叶型菌株在Ｒ０２、Ｒ０４、Ｒ０５、Ｒ０６、Ｒ０８、Ｒ０９、Ｒ１１、Ｒ１４等８个陆地棉品种上的综合抗、感表现首次将分为强致病力（ＸＳ４为代表）、中等偏强致病力（Ｔ９为代表）和中等致病力（ＶＤ８为代表）３类。通过对Ｒ０５、Ｒ０６、Ｒ０８、Ｒ０９、Ｒ１１、Ｒ１４等品种的抗病鉴定     

大丽轮枝菌在棉花品种上的致病力分化研究

 通过 1 9个大丽轮枝菌菌株对 1 6个品种的抗、感反应 ,可以将大丽轮枝菌划分为落叶型和非落叶型两个基本类群。在落叶型类群中 ,根据 8个落叶型菌株在 R0 2、R0 4、R0 5、R0 6、R0 8、R0 9、R1 1、R1 4等 8个陆地棉品种上的综合抗、感表现首次将其分为强致病力 ( XS4为代表 )、中等偏强致病力 ( T9为代表 )和中等致病力 ( VD8为代表 ) 3类。通过对 R0 5、R0 6、R0 8、R0 9、R1 1、R1 4等品种的抗病鉴定 ,可以有效地把原产于江苏南通的落叶型菌株 VD8和原产于美国的落叶型菌株 T9相互区分开来。在非落叶型类群中 ,利用 R1 5、R1 4、R1 3、R1 0等 4个陆地棉品种 ,可以鉴别出 XJ4、XJ1、AY、VD40 4、VD32 6、LY、BP2等 7个菌株的致病基因不同 ,并将其分别定名为 1～ 7号小种。陆地棉 R0 1能抗所有试验用菌株。陆地棉 R1 2能有效地鉴别出强致病力菌系 ,该品种在鉴别强致病力菌系菌株方面有特异作用     

大丽轮枝菌酯酶同工酶的测定

对棉花黄萎病菌不同致病力及致病类型菌系，不同寄主上的大力轮枝菌共１４个菌系的酯酶，进行了聚丙烯酰胺胶平板电泳。结果表明棉花黄萎病不同致病类型菌系有其独特的酯酶同工酶谱。Ｅ６酶带的有无与致病力类型有关，Ｅ３酶带活性与病菌致病力有关，Ｅ３酶带活性与棉花发病病指关联度为０．８５。不同寄主大丽轮枝菌酯酶同工酶总酶带数在７￣１２条之间，主酶带数在２￣４条之间，按Ｅ３酶带活性强、中、弱划分为３个类型。Ｅ３酶带