mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建

选择新城疫病毒(NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因作为黑色素瘤的治疗基因。将小鼠端粒酶逆转录酶(mTERT)启动子、小鼠黑色素瘤酪氨酸酶(Tyr)特异性启动子核心片段以及HN基因分别插入到腺病毒载体穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-2的多克隆位点处,将克隆成功的穿梭载体经Pme I线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,成功构建了肿瘤特异性和组织特异性双启动子调控的HN基因的重组腺病毒载体pAd-mTERTp-mTyrp-HN。将重组腺病毒通过脂质体法转染HEK 293细胞,经RT-PCR鉴定及Western-blotting对HN蛋白的表达水平分析后,大量扩增病毒,经CSCl密度梯度超速离心法纯化病毒颗粒,以50%组织培养感染剂量法(TCID50)测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-TyrpHN和Ad-GFP的最终滴度分别为108.7、109.5、109.25、109.625和109.125,将为下一步利用该重组腺病毒在体内外诱导小鼠黑色素瘤细胞系B16的凋亡及研制动物肿瘤性疾病的基因疫苗提供了理论依据。     

禽腺病毒载体研究进展

人腺病毒载体被广泛地用作转基因工具。然而,人体内预先存在的针对人腺病毒的抗体影响了转基因的效率,阻碍了这些载体在临床上的应用。避免宿主免疫反应的途径之一是开发能将基因转导至人细胞的动物腺病毒载体,而禽腺病毒载体是目前动物腺病毒载体研究中较多的一种。禽腺病毒载体还可插入并表达病原的保护性抗原基因,用于疫苗研制。对禽腺病毒的分子生物学和载体疫苗的深入研究,将对禽类疫病预防起到重要作用。论文详细叙述了禽腺病毒的基因组结构特点以及禽腺病毒载体的研究现状,为研究者提供参考。     

禽腺病毒感染的防控

主要对禽腺病毒引起的产蛋下降综合征、包涵体肝炎、再生障碍性贫血、呼吸道感染、出血性肠炎和免疫力下降等作一介绍,提出相应的防控措施。并以2例临床病例为例,介绍了生产实践中针对腺病毒感染所采取的具体防控措施。以期为广大养殖同仁临床防控该病提供参考。     

禽腺病毒感染的防控

主要对禽腺病毒引起的产蛋下降综合征、包涵体肝炎、再生障碍性贫血、呼吸道感染、出血性肠炎和免疫力下降等作一介绍,提出相应的防控措施。并以2例临床病例为例,介绍了生产实践中针对腺病毒感染所采取的具体防控措施。以期为广大养殖同仁临床防控该病提供参考。     

表达禽腺病毒4型中国流行株Fiber2蛋白重组新城疫病毒的构建与鉴定

利用NDV LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,将禽腺病毒4型(FAdV-4)中国流行株的全长Fiber2基因插入到NDV基因组的P和M基因之间,构建并拯救出重组病毒rLaSota-Fiber2。利用RT-PCR和序列测定,以及Western blot对重组病毒进行了鉴定。结果显示,Fiber2基因插入位置和方向正确,Fiber2蛋白得到正确表达,表达形式为可溶的游离形式而非嵌入到NDV颗粒中。第10代重组病毒的鸡胚致病性试验和在鸡胚中的生长特性研究结果显示,重组病毒的半数鸡胚感染量(EID_(50))最高可达10~(8.5)/100μL,鸡胚平均致死时间(MDT)为120 h, 1日龄雏鸡脑内接种指数(ICPI)和6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)均为0,重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株的低致病特性和对鸡胚良好的高滴度生长适应性。重组病毒与亲本LaSota株生长滴度在相近时间达到峰值,生长动力学特性与亲本株无明显差异。本试验构建的表达FAdV-4中国流行株Fiber2基因的重组病毒rLaSota-Fiber2有望为同时防控NDV和FAdV-4的感染提供安全、廉价和高效的辅助工具。     

鸡禽腺病毒Ⅰ群感染的诊断

介绍了鸡的禽腺病毒感染的流行病学、临床症状、病理变化、诊断要点、类症鉴别及防治,以期为广大养殖户提供参考。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

表达鸡TRAIL基因的重组5型腺病毒构建

本研究采用RT-PCR从鸡脾细胞扩增到TRAII,基因,测序验证后,将扩增的TRAIL基因开放阅读框克隆到pShuttle-CMV上,与pAdeasy-1载体在BJ 5183细菌内同源重组,获得含有TRAIL基因的5型腺病毒重组质粒,进而将Pac Ⅰ线性化重组质粒转染AD-293细胞,收获重组腺病毒.并对后者进行RT-PCR扩增,获得TRAIL基因片段,经western blot鉴定显示构建的重组腺病毒可表达TRAIL蛋白,表明TRAIL基因在构建的重组腺病毒rAd5-TRAIL中得到表达.本研究为下一步的动物试验和研究TRAIL基因的抑瘤作用奠定了基础.     

TRAIL和HN基因融合表达重组腺病毒的构建及其对DT40细胞的抑瘤作用

分析携TRAIL和HN基因的重组腺病毒在DT40细胞中的表达规律及杀伤肿瘤细胞的生物学效应。通过RT-PCR分别从鸡外周血淋巴细胞和新城疫病毒(NDV)LaSota株中扩增出TRAIL和HN基因,通过定点突变和重叠延伸拼接法实现TRAIL和HN基因的2A连接,将获得的目的基因克隆到pShuttle-CMV穿梭载体中,与pAdeasy-1载体在BJ5183细菌内同源重组,构建了包含目的基因的重组腺病毒质粒pAd-TRAIL和pAd-TRAIL-2A-HN,将质粒线性化后转染AD293细胞,包装后的重组腺病毒,经RT-PCR检测、荧光显微镜观察和病毒滴度测定后,将获得的重组腺病毒体外转染禽淋巴白血病DT40细胞,通过RT-PCR和Western blotting检测重组腺病毒的感染性和外源基因的表达情况,采用流式细胞仪检测重组腺病毒对DT40细胞生长的影响以及Ad-TRAIL和Ad-TRAIL-2A-HN对DT40细胞的凋亡作用。PacⅠ酶切证实同源重组成功;RT-PCR、荧光显微镜检测证实重组腺病毒质粒成功导入AD293细胞中且具有良好的感染性,滴度为1.9×1010PFU/mL;Western blot检测结果显示,TRAIL-linker-HN基因能够在DT40细胞中稳定表达并对DT40细胞产生细胞毒作用,且诱导细胞的凋亡率为29.52%,表明TRAIL-linker-HN具有双基因抑瘤的协同效应。     

表达猪流行性腹泻病毒S基因片段重组腺病毒的构建与免疫特性

利用RT-PCR、同源重组等技术构建了含有猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因上3个片段的重组腺病毒质粒pAd-S98～638,pAd-S1～638,pAd-S49838～1384,经PacI酶切后转染HEK-293A细胞,3次噬宽纯化分别获得了重组腺病毒rAd-s498～638,rAd-S1～638,rAd-S498～1384.重组腺病毒于HEK-293A细胞连续传代至20代效价稳定,TCID50分别为每毫升10-6.29、10-5.75、10-6.5.应用猪流行性腹泻病毒阳性血清进行间接免疫荧光抗体试验,在3个腺病毒感染的HEK-293A细胞的胞质见有清晰荧光.将3个重组腺病毒分别免疫小鼠,结果均诱导产生较强的体液免疫应答.结果表明这3个重组腺病毒对S基因的3个片段均可成功表达,并具有较好的免疫原性,为PEDV重组腺病毒活载体疫苗的研究奠定了基础.     

口蹄疫病毒VP1基因siRNA重组腺病毒的构建及其介导的RNAi抑制口蹄疫病毒复制的研究

本研究选择O型FMDV VP1基因上保守序列作为可能的干扰位点,合成了siRNA,将siRNA克隆到pSIREN-Shuttle中,获得siRNA重组表达载体pShuttle-VP1。用限制性内切酶PI-Sce I和I-Ceu I双酶切siRNA重组表达载体和腺病毒质粒载体pAdeno-X,利用体外连接法获得了重组质粒。经过PCR扩增、酶切鉴定及序列测定,证明成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-VP1。利用脂质体转染法,将Pac I线性化的重组腺病毒质粒pAdeno-VP1转染HEK293细胞,包装成重组腺病毒rAdeno-VP1。经过PCR鉴定正确后大量增殖,增殖的重组腺病毒经过浓缩、纯化得到了高滴度的病毒。用终点稀释法测定病毒滴度为2.5×109PFU/mL。将rAdeno-VP1感染IBRS-2细胞后,12 h后再加入100TCID50的FMDV O/HKN/2003。结果显示,重组腺病毒能够抑制FMDV的复制。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性

本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组GP5蛋白的免疫原性,将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内,转染MDCK细胞,获得了重组病毒,免疫新生仔猪,分别在免疫后0～12周采集血清,通过ELISA检测证明,猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSVGP5的抗体.说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力.