水稻核黄素合酶基因的克隆、表达及多克隆抗体的制备

核黄素在生物体内发挥着重要的作用,核黄素合酶(RS)是核黄素合成过程中的一个关键酶。本研究克隆了水稻核黄素合酶基因(OsRS),并将其在Escherichia coli中高效表达。表达产物(包涵体),先用6 mol/L盐酸胍将其溶解,再用8 mol/L尿素透析,将获得的蛋白免疫家兔制备了多克隆抗体。并将抗体与原核表达的OsRS和提取的水稻叶组织总蛋白进行Western blot分析,确定所制备的多克隆抗体具有较好的免疫反应性,为深入解析水稻中核黄素合酶的催化活性和功能奠定了基础。     

拟南芥纤维素合酶的抗体制备与检测

将拟南芥CesA家族基因的高变区克隆到融合表达载体pGEX-4T-3中,构建重组质粒pGEX-AtCe-sAs,在大肠杆菌JM109中经IPTG诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白(GST-AtCESAs)。采用GST亲和层析法纯化GST-AtCESAs并制备了多克隆抗体。Western-blotting检测表明,抗体Anti-CESA4和Anti-CE-SA7存在明显的交叉反应,Anti-CESA1、Anti-CESA3、Anti-CESA6、Anti-CESA2、Anti-CESA5、Anti-CESA8均能在拟南芥原生质膜上检测到特异免疫条带,这为进一步深入研究拟南芥纤维素合成机制提供了有利条件。     

金霉素多克隆抗体的制备与鉴定

    研究制备能有效用于金霉素残留检测的特异性多克隆抗体采用戊二醛法和混合酸酐法合成2种不同的金霉素-BSA完全抗原,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,应用ELISA法鉴定抗金霉素多克隆抗体结果表明,2种血清的抗体效价最高均达32×105,而戊二醛法制备的抗原产生的抗体具有更高的亲和力,抑制率为50%时的金霉素的质量浓度(IC50)为962 μg·mL-1,金霉素的最低检测限为667 ng·mL-1,金霉素和四环素的交叉反应率为77%研究结果为畜产品中四环素类抗生素残留的检测奠定了较好的基础     

越南水稻黄矮病毒多克隆血清抗体的制备

[目的]制备用于检测水稻黄矮病毒(RYSV)的多克隆抗体,为水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断提供技术支持.[方法]利用两种不同来源的RYSV抗原免疫家兔,一种是从受感染的水稻病叶组织纯化获得RYSV病毒粒子;另一种是从越南RYSV分离株克隆出完整N蛋白编码基因,然后将其连接至pET-28a载体上,在大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中进行诱导表达获得N蛋白抗原.其中,N蛋白抗原又以两种形式(洗脱纯化N蛋白和N蛋白条带聚丙烯酰胺切片匀浆)对家兔进行免疫.最后,采用PTA-ELISA分析评估家兔抗体血清(多克隆抗体)对水稻叶片和黑尾叶蝉RYSV的特异性和敏感性.[结果]分离自越南RYSV分离株的N基因由1542个核苷酸组成,与来自我国和日本RYS分离株N基因序列进行比对,其核苷酸序列同源性分别为98.1%和97.9%,对应的推导氨基酸序列同源性为83.4%和99.4%.以RYSV病毒粒子、洗脱纯化N蛋白和N蛋白条带聚丙烯酰胺切片匀浆3种抗原免疫家兔获得的多克隆抗体均能有效检测出水稻植株中的RYSV,其中,感病植株的OD405分别为1.449、2.337和1.649,健康植株的OD405分别为0.375、0.294和0.283.PTA-ELISA检测结果表明,获得的多克隆抗体能从单个带病毒黑尾叶蝉中检测出RYSV,且该结论在RT-PCR检测中得到进一步验证.[结论]制备获得的多克隆抗体对RYSV具有较高特异性和敏感性,可用于水稻和黑尾叶蝉上的病毒诊断,同时表明以含有病毒植物蛋白的聚丙烯酰胺切片直接注射免疫模型动物制备多克隆抗体具有可行性.     

己烯雌酚多克隆抗体的制备研究

合成了具有己烯雌酚基本分子结构特性并带有一个羧基活性基团的半抗原CP-DES,用混合酸酐法将其与BSA偶联后免疫6只BALB/c雌性小鼠,获得了特异性的己烯雌酚多克隆抗体。以所得抗体建立间接竞争性酶联免疫吸附分析法(cELISA)用于己烯雌酚的检测,最低检测限为0.04 ng.mL-1。交叉反应表明,己烯雌酚的特异性抗体与其结构类似物无明显交叉反应。     

蔗糖合酶抗体制备及其在水稻灌浆期蔗糖合酶含量检测中的应用

采用匀浆粗提、硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100、DEAE-32、Sepharose CL-6B等方法从水稻品种武育粳3号籽粒中分离纯化蔗糖合酶,所得的酶蛋白在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳胶上呈现一条深染色的蛋白酶带。HPLC测定其浓度为71．2％,SDS—PAGE测得的酶分子量为380ku。用得到的酶蛋白作为抗原,通过皮内多位点分次注射法免疫新西兰白兔获得免疫抗体,用此抗体成功地检测到水稻籽粒灌浆过程中蔗糖合酶蛋白的含量变化。     

Harpinxoo多克隆抗体制备、鉴定与应用

 以纯化harpin蛋白为抗原免疫新西兰白兔，制备兔抗Harpin蛋白的多克隆抗体，经ELISA法测定抗体效价为1：2000，经亲和层析纯化，Western blot分析制备抗体与原核细胞体外表达的harpin蛋白可以特异性结合，表明该抗体的特异性良好。应用该抗体验证harpin编码基因在转基因水稻中在翻译水平的正常表达。因此，兔抗harpin抗体的成功制备，为进一步深入研究harpin的生物学功能、细胞定位以及在其他植物中的表达等奠定基础。     

己烯雌酚多克隆抗体的制备研究

合成了具有己烯雌酚基本分子结构特性并带有一个羧基活性基团的半抗原CP-DES,用混合酸酐法将其与BSA偶联后免疫6只BALB/c雌性小鼠,获得了特异性的己烯雌酚多克隆抗体。以所得抗体建立间接竞争性酶联免疫吸附分析法(cELISA)用于己烯雌酚的检测,最低检测限为0.04 ng.mL-1。交叉反应表明,己烯雌酚的特异性抗体与其结构类似物无明显交叉反应。     

杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析

为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。     

水稻丙酮酸脱氢酶激酶1多克隆抗体的制备

水稻丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)基因位于水稻基因组的第7条染色体上,其cDNA全长为1 498 bp,编码有363个氨基酸残基的多肽链,主要在叶片中表达。为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,本研究构建水稻PDK1的原核表达载体,重组质粒转化大肠杆菌诱导表达,得到分子量大概在41 ku的重组蛋白,经纯化后免疫新西兰大白兔成功制备水稻PDK1多克隆抗体。     

肌肉生成抑制因子多克隆抗体的制备与鉴定

运用纯化的肌肉生成抑制因子(myostatin,简称MSTN)蛋白为免疫原制备弗氏佐剂疫苗,主动免疫健壮的雄性青年家兔以制备抗血清,运用饱和硫酸胺沉淀法对所制备的抗血清成功地进行粗提．Western-Blot和ELISA检测结果是;当抗原质量浓度为20μg／mL,抗体稀释800倍时,所测的P／N仍大于2,证明抗体的制备是成功的,抗体效价为1：12800,且特异性较高．抗体稀释400倍时,血清抗体D450nm值为0．624,P／N值为5．552．     

传染性喉气管炎病毒gD蛋白多克隆抗体制备与运用

鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的一种急性接触性上部呼吸道病。ILTV表面糖蛋白g D能刺激机体产生良好体液和细胞免疫应答,编码该蛋白的g D基因是ILTV主要抗原性基因之一。以ILTV-LJS09株基因组为模板,PCR扩增g D基因主要抗原区域(54~344 aa)及g D基因,分别亚克隆至p GEX-6P-1和p CAGGS载体,构建原核表达载体p GEX-6P-1-g D163/1032和真核表达载体p CAGGS-g D。利用纯化ILTV、原核表达纯化获得重组蛋白r-g D和真核质粒p CAGGS-g D,对新西兰大白兔进行免疫与加强免疫,制备兔抗ILTV g D多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验确定ILTV g D多克隆抗体和ILTV感染的鸡肝癌细胞表达蛋白发生反应,表明制备的ILTV g D多克隆抗体能识别ILTV天然抗原表位,最佳稀释度为11 000;用ILTV感染的LMH细胞培养物进行Western Blot分析,在40 ku左右出现一条特异性条带,与预期ILTV g D蛋白大小相符。激光共聚焦定位感染鸡肝癌细胞中ILTV g D蛋白,发现ILTV g D蛋白主要表达于感染细胞胞浆及融合细胞交界处。     

磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗体制备

磺胺二甲基嘧啶(SM2)为只具有反应原性而无免疫原性的半抗原。本试验将SM2重氮化后分别连接人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA),合成人工抗原,经紫外光谱扫描验证偶联结果,计算结合比分别为4∶1、3∶1。用偶联物SM2-HSA免疫新西兰白兔,以SM2-OVA为包被原,4次免疫后ELISA方法测定抗血清效价为1∶12 800。表明抗原合成成功,这为小分子药物残留的免疫学检测奠定了技术基础。     

水稻二半乳糖甘油酯合成酶DGD响应热胁迫的 生物信息学和基因表达分析

利用比较基因组学方法获得5个水稻二半乳糖甘油酯合成酶(Os DGD)同源基因;运用生物芯片分析,发现Os DGD参与对热胁迫和干旱胁迫的应答;采用实时定量PCR技术,分析5个Os DGD在热胁迫幼穗6~7期日本晴、9311和N22水稻剑叶中的表达特征,发现Os DGD1、Os DGD2和Os DGD3在耐热品种N22中的表达明显受到热胁迫诱导,由此推测,Os DGD可能参与了水稻的耐热信号传导。     

水稻密码子优化的cry1Ca 基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在.对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免...     

Luman-端融合蛋白单克隆抗体的制备

【目的】制备小鼠抗Luman-N端融合蛋白单克隆抗体。【方法】将GST-Luman-N端载体转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳,用电洗脱的方法纯化融合蛋白;以纯化的融合蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,利用间接ELISA方法筛选阳性孔,采用有限稀释法进行亚克隆,筛选具有抗体分泌活性的单克隆细胞株;应用Western Blot、间接ELISA等方法进行克隆株稳定性、抗体特性的鉴定。【结果】获得1株能稳定分泌抗Luman-N端融合蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2C8),其腹水ELISA单抗效价为1∶1×107。亚型鉴定和亲和力常数分析表明,2C8产生的单克隆抗体亚型为IgG2b型,其亲和力常数约为1×107。Western Blot分析证明,该株单抗能与原核表达的Luman-N端融合蛋白特异性结合,与GST-LRF-N端融合蛋白没有特异性结合。染色体分析结果表明,2C8细胞株染色体数目为(53±2)对。【结论】获得了抗Luman-N端融合蛋白的抗体,该抗体具有良好的特异性和结合活性,可用于对Luman-N端蛋白的进一步研究。     

氯霉素人工多克隆抗体的制备、纯化与特性分析

通过合成氯霉素完全抗原,制备氯霉素的多克隆人工抗体,建立氯霉素(CAP)的免疫学检测方法。采用重氮法合成氯霉素完全抗原,以氯霉素牛血清白蛋白(CAP-BSA)免疫大耳白家兔,用ELISA方法进行鉴定和特性分析。结果显示,该抗血清与链霉素、青霉素、四环素等常见抗生素的交叉反应率均小于2.1%,IC50为13.65 ng/ml,检测限达到1.01μg/L。获得了选择性好、特异性较高的氯霉素特异抗体,可用于氯霉素的快速定量检测。     

水稻Ds插入易倒伏突变体的形态和生理鉴定

为了从形态学和生理学角度初步分析水稻Ds插入突变体出现倒伏的可能原因,继而为进一步开展水稻倒伏相关基因的功能研究提供参考,比较了该突变体与野生型在株高、茎上各主要节间的长度、粗度、茎壁厚、叶鞘厚度以及根、茎、叶片、叶鞘、穗和稃片中纤维素和硅含量的差异.结果显示,易倒伏突变体各主要器官中纤维素含量均明显下降,硅在各器官中的分配方式也出现不同于野生型的变化.研究表明,各器官中纤维素含量下降引起的植株机械强度减弱可能是导致突变体易于倒伏的主要原因.