反刍动物埃立克体荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速、准确地检测反刍动物埃立克体,本研究以反刍动物埃立克体pCS20为靶基因设计特异性引物和探针,建立了TaqMan和Eva Green荧光定量PCR方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与OIE推荐的套式PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,本方法特异性强,与牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、环形泰勒虫、犬埃立克体、牛埃立克体、马埃立克体和立氏埃立克体无交叉反应;TaqMan和Eva Green荧光定量PCR对pCS20质粒标准品的最低检测限分别为17.4拷贝·μL^-1和1.74拷贝·μL^-1,标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对420只钝眼蜱样本的检测显示,TaqMan和Eva Green荧光定量PCR的检出率分别为25.48%和29.29%,与套式PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为反刍动物埃立克体的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

驽巴贝斯虫TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立快速检测驽巴贝斯虫Bc-48基因的方法,本研究根据Bc-48保守基因序列设计合成特异性引物和MGB荧光探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,经条件优化后建立了检测Bc-48基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测驽巴贝斯虫,而对其它病原检测均为阴性;该方法最小检出量为5.17×10~1拷贝/μL的标准质粒,敏感性是常规PCR的100倍;组内与组间重复性试验的变异系数均小于1%,重复性好;采用所建立的方法和常规PCR分别对90份临床样品进行检测,结果显示本研究建立的驽巴贝斯虫TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于驽巴贝斯虫病临床样品诊断、流行病学调查。本研究为蜱传马梨形虫病的防控提供新的方法。     

微滴式数字PCR定量检测禽偏肺病毒方法的建立

为建立禽偏肺病毒(aMPV)微滴式数字PCR (ddPCR)检测方法，本研究以aMPV F基因为靶基因，根据其保守区域设计特异性引物和探针，通过各反应条件的优化，初步建立检测aMPV的dd PCR方法。反应条件优化结果显示，最佳引物终浓度1μmol/μL，探针终浓度0.5μmol/μL，退火温度56℃。绘制的标准曲线显示，重组质粒标准品稀释倍数的对数与相应质粒检出拷贝数的对数呈良好的线性关系(R²=0.999 8)。采用该方法同时检测aMPV、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、禽呼肠孤病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒和禽腺病毒，结果显示，仅aMPV检测为阳性，其他病原均为阴性。特异性较强。将p MD18-aMPV重组质粒标准品10倍倍比稀释(105～10⁹,4.3×10³拷贝/μL～4.3×10^-1拷贝/μL)后作为模板，采用该方法检测，结果显示该方法对重组质粒标准品的检测限为4.3拷贝/μL，比荧光定量PCR (qPCR)检测限(43拷贝/μL)敏感。对3个稀释度质粒标准品...     

蜱传反刍动物艾立希体巢式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测反刍动物艾立希体的方法,本研究根据GenBank中登录的反刍动物艾立希体pCS20基因保守区设计2对特异性引物,经各反应条件的优化,建立了反刍动物艾立希体巢式PCR检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测反刍动物艾立希体DNA,而对牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的检测均为阴性,具有良好的特异性;该方法灵敏度可达1.04×101拷贝/μL,是反刍动物艾立希体实时荧光PCR检测试剂盒的10倍,是常规PCR的1 000倍。对50只血蜱、花蜱和微小牛蜱DNA进行检测,巢式PCR、反刍动物艾立希体实时荧光PCR检测试剂盒和常规PCR的阳性检出率分别为26.0%,14.0%和0.0%。本试验建立的巢式PCR检测方法适用于反刍动物艾立希体病的早期诊断和分子流行病学调查,为蜱传反刍动物艾立希体病的防控提供技术支持。     

基于Taq Man探针的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量PCR检测方法的研究

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒pMD-ORF7为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线建立了PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL;用该方法对6份不同的组织样品进行重复性检测.结果显示具有良好的重复性和重现性.对阳性组织病料的检测表明该方法与常规RT-PCR阳性符合率为100%.但检测灵敏度高出常规RT-PCR 100倍.     

牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种灵敏、特异、快速的牛巴贝斯虫检测方法,针对牛巴贝斯虫Rap-1a基因设计引物进行PCR扩增,然后构建重组质粒制作标准品,经过优化反应体系、绘制标准曲线,建立了牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR方法,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测,同时利用该方法对37份田间样品进行检测。结果显示：建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程式为y=-3.362×Log（X）+43.32,相关系数R2=0.999,扩增效率为98.4%。该方法的灵敏度为1.0×102 copies/μL,是普通PCR（1.0×104 copies/μL）的100倍。该方法对牛双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫等7种常见的牛梨形虫病检测结果均为阴性,组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%,37份田间样品的阳性检出率为67.5%。结果表明,本试验建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于牛巴贝斯虫的诊断,从而为其流行病学调查提供了快速有效的检测方法。     

蜱传牛巴贝斯虫套式PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测牛巴贝斯虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛巴贝斯虫rap-1基因保守区设计2对特异性引物,经反应条件的优化,建立了牛巴贝斯虫套式PCR检测方法。结果显示,该方法可以特异地检测牛巴贝斯虫,而对双芽巴贝斯虫、牛环形泰勒虫和弓形虫的检测均为阴性;该方法的灵敏度可达1.3×10~1拷贝/μL,是牛巴贝斯虫荧光定量PCR检测试剂盒的10倍,是常规PCR的1 000倍。对50只扇头蜱和微小牛蜱DNA进行检测,套式PCR、牛巴贝斯虫荧光定量PCR检测试剂盒和常规PCR的阳性检出率分别为100.0%、72.0%和0。本实验建立的套式PCR检测方法适用于牛巴贝斯虫病的早期诊断和分子流行病学调查,为蜱传牛巴贝斯虫病的防控提供技术支持。     

猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究在CSFV 5'端非编码区设计一对引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的重组质粒为标准品,建立了一种检测CSFV的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验.结果显示,可特异地检测CSFV,该方法在101～107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度可达10拷贝/μL,重复...     

环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种快速、敏感检测牛环形泰勒虫的方法,本研究根据GenBank中登录的牛环形泰勒虫Tams1基因序列,设计合成1对特异性引物,通过优化反应条件,建立了检测牛环形泰勒虫SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。研究结果显示,该方法可以特异地检测牛环形泰勒虫,而对牛巴贝斯虫、反刍动物艾立希体和弓形虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达到180拷贝/μL,比常规PCR敏感10倍;组内和组间变异系数均小于1.0%。对15份临床血液样品和20只璃眼蜱进行检测,SYBR Green I荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为42.86%和28.57%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有特异性强、敏感性高的特点,可准确、高效检测牛环形泰勒虫,为牛环形泰勒虫病防控提供技术支持。     

野生型非洲猪瘟病毒多重数字PCR方法的建立

为建立一种鉴别诊断野生株和基因缺失株非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的方法,针对ASFV的B646L、EP402R、DP96R基因保守序列设计3套引物和探针,优化三重荧光定量PCR体系作为基础建立微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)检测方法,并对方法的特异性、灵敏性及重复性进行评估。结果显示,优化后的多重荧光定量PCR检测方法的标准曲线线性关系良好,对PRRSV、PEDV、PRV、VSV、PCV、RNase-free水、重组质粒标准品进行特异性检测,特异性良好;重复性试验结果显示,变异系数均小于2%;对3种重组质粒的最低检测下限均为10² copies/μL。参照上述多重荧光定量PCR方法优化后的条件,进行多重ddPCR检测方法的建立,并且对该方法进行评价。结果显示,ddPCR检测方法标准曲线的线性关系良好;特异性及重复性良好;最低检测下限B646L为11.6 copies/μL、EP402R为13.3 copies/μL、DP96R为16.9 copies/μL;ddPCR的检测灵...     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株微滴数字PCR鉴别方法的建立

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的鉴别诊断和准确定量的微滴数字PCR(ddPCR)方法,本研究以PRV gD和gE基因为靶基因,设计并合成了2套特异性引物和Taq Man探针,建立了分别针对PRV gD和gE基因的dd PCR方法。结果显示,本研究建立的dd PCR方法能够特异性地鉴别检测PRV野毒株和疫苗株,与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等均无交叉反应;该方法针对PRV gD、gE基因的检测限分别为3.9拷贝/μL、2.3拷贝/μL,分别比相应的荧光定量PCR (qPCR)方法敏感性高10倍和5倍;针对PRV gD、gE基因的批内和批间重复性试验结果变异系数(C.V)均小于4%;通过对45份临床样品的检测,结果显示,与病毒分离方法相比,dd PCR方法敏感性为91.7%,特异性为97.2%,符合率为97.8%;与dd PCR方法相比,q PCR的敏感性为83.3%,特异性为94.3%,符合率为95.6%。本研究建立的dd PCR方法在检测低拷贝临床样品时敏感性更高、特异性强、重复性好,可以作为PRV野毒株与疫苗株的鉴别、准确定量的有效检测手段。     

鹅细小病毒、番鸭细小病毒及鸭圆环病毒多重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与临床应用

为建立鉴别检测鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)及鸭圆环病毒(DuCV)的方法，本研究分别针对GPV、MDPV NS基因与Du CV Rep基因，设计特异性引物和Taq Man探针，经优化反应条件，建立了同一体系中同时鉴别检测GPV、MDPV及Du CV的Taq Man荧光定量PCR方法。利用该方法检测GPV、MDPV、Du CV及禽流感病毒、新城疫病毒、鸭瘟病毒、减蛋综合征病毒、鸭坦布苏病毒、番鸭呼肠孤病毒等主要水禽源病毒，结果显示，该方法仅能扩增出GPV、MDPV及Du CV，与其他主要水禽源病毒均无交叉反应，特异性强；利用该方法检测等体积混合后的GPV、MDPV及Du CV质粒标准品混合物，结果显示，该方法对3种质粒标准品的检测限均为7.5×10¹拷贝/μL，普通单一PCR对上述3种质粒标准品混合物的检测限均为7.5×10³拷贝/μL，表明本研究建立方法的敏感性高于普通PCR；该方法组内与组间重复性试验的变异系数均小于2.0%，重复性好。利用该方法与MDPV和GPV双重荧光定量PCR方法及Du CV荧光定量PCR方法同时检测...     

羊泰勒虫荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种敏感、快速的羊泰勒虫检测方法,本研究根据GenBank中登录的羊泰勒虫18S rRNA保守区设计1对特异引物,经各反应条件的优化,建立了羊泰勒虫荧光定量PCR检测方法。结果显示该方法可以特异地检测羊泰勒虫,而对卵形巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊巴贝斯虫和瑟氏泰勒虫检测均为阴性;该方法的灵敏度可达2.08×10~1拷贝/μL,比普通PCR灵敏度高100倍。组内及组间重复试验变异系数均小于5%。对50份临床样品进行检测,荧光定量PCR和常规PCR的阳性检出率分别为48%和38%。本实验建立的荧光定量PCR检测方法适用于羊泰勒虫定量分析和分子流行病学调查。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。     

弓形虫TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、敏感的弓形虫检测方法,本研究根据弓形虫GRA7基因保守序列设计特异性检测引物和TaqMan-MGB探针,建立了弓形虫荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法能特异地检测弓形虫DNA,而对新孢子虫、牛巴贝斯、马驽巴贝斯等虫DNA的检测均为阴性,具有良好的特异性;经3D数字PCR判定,其最低检测限为4.58拷贝/μL,灵敏度是常规PCR的1 000倍;重复性试验的组内、组间变异系数均小于5%;对62份疑似弓形虫感染流产的胎牛脑组织DNA进行检测,荧光定量PCR阳性检出率为24.19%(15/62),常规PCR为19.35%(12/62),阳性样品均包含于荧光定量PCR阳性样品中。本研究建立的荧光定量PCR检测方法可用于弓形虫病的早期诊断和日常监测,为监控弓形虫"带虫宿主"提供了良好的技术支持。     

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法，本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，设计2对特异性引物，经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域，构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV，并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示，该方法的最适退火温度为59℃，扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示，除Pm和RHDV有特异性扩增条带外，其余相关病原均无扩增条带，特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板，经该双重PCR方法扩增。结果显示，该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL，对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL，敏感性较高；对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致，重复性较好。对100份临床...     

猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立和评价

为建立猪丹毒丝菌的快速检测方法,本研究根据猪丹毒丝菌荚膜多糖的保守区域设计特异性引物,通过优化反应体系建立了检测猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR方法。并对人工感染小鼠和临床病例样品进行检测。结果显示,质粒标准品在5.52×10~8拷贝/μL～5.52×10~2拷贝/μL范围内呈良好的线性关系;该方法与其它6种猪常见细菌均无交叉反应;最低可检测到20拷贝/μL的阳性质粒标准品,比普通PCR方法敏感性高100倍;批内和批间变异系数均小于3%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以用于猪丹毒的早期诊断和生产实际中大批量临床样品的猪丹毒丝菌检测。     

兔源F型多杀性巴氏杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

为建立特异性强且敏感性高的兔源F型多杀性巴氏杆菌(Pm)快速检测方法，本实验根据F型Pm fcbD基因的保守序列设计特异性引物和探针，经反应条件优化，建立了检测兔源F型Pm的荧光定量PCR方法。利用该方法检测兔源F型Pm、兔源A和D型Pm、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、魏氏梭菌和金黄色葡萄球菌等临床常见兔源病原菌，结果显示，该方法仅对兔源F型Pm检测为阳性，其余病原菌均为阴性，特异性强。利用该方法分别检测10倍倍比稀释(1×10⁸拷贝/μL～1×10⁰拷贝/μL)的兔源F型Pm基因组DNA，进行敏感性试验，结果显示该方法的检测限为10拷贝/μL，敏感性分别是已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法的100倍和10倍，敏感性高。利用该方法对不同稀释度的质粒标准品进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间变异系数均小于3%，重复性好。利用该方法检测64份已知结果的临床样品，结果显示该方法的检测结果与已报导的双重PCR方法和环介导等温扩增方法检测结果的符合率均为100%，准确性高。本研究首次以fcbD为靶基因建立兔源F型Pm的荧...