单增李斯特菌谷氧还蛋白Grx负调控渗透转运系统OpuC转录

旨在通过构建单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)谷氧还蛋白(glutaredoxin,Grx,由lmo2344编码)的基因缺失株以研究其与渗透转运系统(OpuC)相关基因转录的调控关系.LM基因缺失株采用本实验室已建立的同源重组方法构建并筛选获得.利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和绿...     

单增李斯特菌双元调控系统hssS/hssR缺失株的构建及其生物学特性

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种重要的食源性人畜共患病原菌,可抵抗外界多种不利因素的影响,如酸、碱、渗透压和氧化应激.双元调控系统(two-component system,TCS)是细菌适应环境的重要调控系统,为了探明双元调控系统HssS/HssR对单增李斯特菌抗应激能力及毒力...     

寡肽转运蛋白lmo2193基因缺失对单增李斯特菌环境适应性的影响

研究通过比较三株单增李斯特菌在不同环境下的适应性,探究lmo2193基因对单增李斯特菌环境应激的影响。测定不同温度、EtOH浓度、pH、NaCl浓度条件下的生长趋势,绘制生长曲线。结果显示,缺失株的生长速度明显较野毒株、回补株生长缓慢,缺失株对42℃和4.5%无水乙醇(EtOH)胁迫条件下的耐受性明显低于野毒株、回补株。表明LM90SB2菌株lmo2193基因的缺失会降低其对环境的适应性,为进一步探究寡肽转运蛋白在单增李斯特菌中的作用奠定了基础。     

单增李斯特氏菌actA基因的克隆及原核表达

利用PCR技术从单增李斯特氏菌中扩增出actA基因,将PCR产物纯化后克隆到pMD 18Tsimple vector中,成功构建出克隆载体pMD-18T/actA。以BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切pMD-18T/ActA和表达载体pGEX-3X,将纯化的actA基因亚克隆到表达载体pGEX-3X。构建的重组表达载体pGEX-3X/ActA转化到E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,可见约120 ku外源蛋白带,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应。该研究为ActA的生物学特性和功能的研究及诊断试剂的研制奠定了基础。     

谷氧还蛋白和硫氧还蛋白对动物抗氧化应激生物学效应的研究进展

谷氧还蛋白和硫氧还蛋白分别是动物机体抗氧化酶系统和抗氧化非酶系统的重要成员,具有多种生物学作用,在调节机体的氧化还原反应、抑制细胞凋亡和肠道保护方面起着重要作用.本文结合谷氧还蛋白和硫氧还蛋白的结构与功能、抗氧化机制及抑制细胞凋亡的最新研究近况,就谷氧还蛋白和硫氧还蛋白对动物抗氧化应激生物学效应的研究进行了综述.     

单增李斯特标准菌NrdD基因插入突变株的构建

利用同源重组的原理构建了单增李斯特氏菌NrdD基因插入突变株,从大肠杆菌基因组中分别扩增出NrdD基因上下游同源臂,与pKSV7质粒相连,构建成功重组突变载体pKSV7-D1D2,将其电转入单增李斯特菌后,用氯霉素抗性平板筛选得到NrdD基因插入突变株,并对突变菌株序列测定,证明回复突变株构建成功。该突变株可在严格无氧环境中生存,为进一步研究NrdD基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发奠定了基础。     

谷氧还蛋白1和硫氧还蛋白1基因在云南乌金猪不同组织中的表达特点及L-组氨酸对其在氧化应激细胞中表达的影响

本试验旨在研究抗氧化基因谷氧还蛋白1(GRX1)、硫氧还蛋白1(TRX1)在云南乌金猪脑垂体、下丘脑、甲状腺、胸腺、胰腺、生殖腺、肝脏、皮肤、十二指肠、空肠、回肠11种组织中的差异表达,探讨L-组氨酸对乌金猪氧化应激细胞中GRX1、TRX1基因表达的调节作用。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测乌金猪组织中GRX1、TRX1基因表达;以过氧化氢(H2O2)为氧化应激源建立氧化应激细胞模型,探讨L-组氨酸对GRX1、TRX1基因表达的调节作用。结果表明:1)GRX1、TRX1基因在乌金猪被检测组织中均有表达,肝脏表达量最高,其次是皮肤、空肠,其他组织中的表达量相对较低;2)乌金猪组织中TRX1基因表达量明显高于G RX1基因表达量;3)细胞培养结果表明,受到H2O2刺激时,氧化应激细胞中GRX1、TRX1基因产生过表达,L-组氨酸对氧化应激细胞或非应激细胞中GRX1、TRX1基因表达具有调节作用,其适宜浓度约为280μg/mL。乌金猪GRX1、TRX1基因表达具有明显组织特异性,H2O2可诱导氧化应激细胞中GRX1、TRX1基因产生过表达,添加适宜浓度的L-组氨酸可以调节氧化应激细胞或非应激细胞中GRX1、TRX1基因表达。结果提示,通过营养途径可诱导乌金猪体内G RX1、TRX1基因的表达,这是缓解机体氧化应激损伤和增强抗氧化能力的一种有效方式。     

双元调控系统LisRK对单增李斯特菌抗酸应激与侵袭力作用的研究

【目的】 试验旨在阐明双元调控系统LisRK在单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)抵抗不利环境应激以及感染过程中的作用。【方法】 以参考菌株10403S为亲本株,利用穿梭质粒pKSV7通过同源重组方法构建lisRK基因缺失株,并基于表达质粒pIMK2构建了lisRK回补株;比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK在酸(pH 4.5)、渗透压(5% NaCl)和氧化(10 mmol/L H₂O₂)应激条件下的生长与存活能力及其对胃腺癌细胞MGC803和肠上皮细胞Caco-2的侵袭率,进一步比较了亲本株10403S、缺失株ΔlisRK与回补株CΔlisRK经腹腔注射感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量。【结果】 应激试验结果显示,lisRK基因缺失显著降低单增李斯特菌在酸应激(pH 4.5)条件下的生长能力,但不影响该菌在5% NaCl和10 mmol/L H₂O₂中的生长能力;缺失株ΔlisRK在强酸应激条件下(pH 2.5)的存活率(0.57%)极显著低于亲本株(2.07%)与回补株(1.97%)(P < 0.01)。细胞侵袭试验显示,缺失株ΔlisRK对肠上皮细胞Caco-2和胃腺癌细胞MGC803的侵袭率分别为2.04%和0.13%,极显著或显著低于亲本株与回补株(P < 0.01;P < 0.05)。小鼠感染试验显示,在感染后48 h,缺失株ΔlisRK在小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为7.42×10⁷和1.87×10⁷ CFU,均低于亲本株和回补株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量,但并无显著性差异(P > 0.05)。【结论】 双元调控系统LisRK缺失减弱单增李斯特菌的抗酸应激能力和对宿主细胞的侵袭能力。     

单增李斯特菌hly基因缺失株的构建及重要特性分析

为构建单增李斯特菌(LM)hly基因缺失株,并分析其生物学特性和免疫保护效果,本研究利用同源重组技术获得基因缺失株LM△hly112-153,研究该缺失株对巨噬细胞的侵袭力、溶血能力并测定其LD50,同时评价该缺失株对小鼠的免疫保护效果。结果显示经PCR扩增及序列分析表明获得基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对巨噬细胞的侵袭能力显著下降(p<0.01);其溶血活性比野生株降低2个滴度;并且该缺失株对BALB/c小鼠的LD50为4.253×108 cfu,高于野生株3个数量级;免疫保护试验显示,经缺失株免疫的小鼠对野生株攻毒有75%的免疫保护率。本研究构建了基因缺失株LM△hly112-153,该缺失株对小鼠具有较好的免疫保护效果,以上研究为减毒李斯特菌疫苗载体的研发奠定重要基础。     

单增李斯特氏菌ActA的原核表达与纯化

PCR扩增单增李斯特氏菌ActA基因,纯化后克隆到pMD 18T simple vector 中,以BamHI和EcoRI双酶切克隆载体pMD-18T/ActA,再将其亚克隆到表达载体pGEX-3X中,获得重组质粒 pGEX-3X/ActA,转化E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导融合蛋白(GST-ActA)表达,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应.试验采用Glutathione Sepharose 4B亲合层析纯化融合蛋白.对单增李斯特氏菌ActA的原垓表达与纯化的研究为单增李斯特氏菌诊断试剂的研制及Acth的免疫原性研究奠定了基础.     

溶血素基因缺失对单增李斯特菌在小鼠肠道内定殖的影响

旨在探究单增李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)溶血素hly、llsB基因对小鼠肠道的影响。在构建Lm的hly基因缺失株基础上,以Lm90SB2及溶血素基因缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB为试验菌,进行生长曲线、溶血活性以及器官载菌量的测定。结果：缺失株在不同条件下的生长特性与亲本株相比无明显差异;Lm90SB2、Lm90SB2-ΔllsB的溶血效价分别为1log2、2log2,而Lm90SB2-Δhly基本无溶血现象。缺失株Lm90SB2-Δhly、Lm90SB2-ΔllsB的肠道载菌量均低于亲本株Lm90SB2(P<0.05),在各个时间点肠道中的细菌定殖率依次为Lm90SB2>Lm90SB2-Δhly>Lm90SB2-ΔllsB。本研究表明,hly、llsB基因对Lm在小鼠肠道内定殖可能有直接或间接的调控作用,试验结果为进一步研究hly、llsB基因在Lm致病过程中的作用提供一定的理论依据。     

糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响

为了探明糖基转移酶GalU对单增李斯特菌致病性的影响,本研究利用同源重组技术构建了galU基因缺失株,分析了亲本株ScottA、缺失株ΔgalU和回补株CΔgalU的生长能力、对细胞的黏附侵袭能力以及对小鼠的致病性。生长试验结果显示,galU基因缺失并不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力。细胞侵染试验结果显示,ΔgalU对肠上皮细胞Caco-2的黏附率(0.74±0.18)%和侵袭率(0.70±0.10)%均显著低于亲本株ScottA的黏附率(2.01±0.11)%和侵袭率(2.48±0.25)%,回补株CΔgalU与亲本株的黏附侵袭率则并无显著性差异。免疫印迹结果显示,内化素InlB在ΔgalU细菌表面的锚定量显著低于亲本株,但其表面InlA的锚定量与亲本株并无显著性差异。小鼠试验结果显示,ΔgalU感染的小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量分别为(3.76×10~7±1.41×10~7)CFU/g和(2.88×10~7±2.31×10~7)CFU/g,均显著低于亲本株感染小鼠肝脏和脾脏中的细菌载量;此外,ΔgalU感染组小鼠的存活率高于亲本株,但与回补株感染组小鼠的存活率一致。上述结...     

单增李斯特菌srtA基因缺失株的构建及srtA基因对其毒力的影响研究

为了研究srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2毒力的影响,本研究利用同源重组技术构建了LM90SB2 srtA 基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA,比较分析了亲本株LM90SB2与缺失株LM90SB2-ΔsrtA对MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC 4种细胞系的粘附、侵袭、胞内增值能力及LM90SB2和LM90SB2-ΔsrtA 感染小鼠后,小鼠的LD50及肝脏、脾脏、脑载菌量变化差异。结果显示,本研究成功构建了srtA 基因缺失株;与亲本株LM90SB2比较,缺失株LM90SB2-ΔsrtA 对RAW264.7和SIEC的粘附率、侵袭率及胞内细菌数量均下降,且差异具有显著统计学意义(p <0.05);小鼠 LD50降低了21.38倍,肝脏、脾脏载菌量降低,差异具有显著统计学意义(p <0.05)。本研究结果表明,srtA 基因对单增李斯特菌LM90SB2的毒力具有关键作用,参与粘附、侵袭BMEC,该研究结果为进一步阐明单增李斯特菌毒力因子的致病机制提供理论依据。     

单增李斯特菌内化素家族蛋白的研究进展

单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种革兰阳性病原菌,是食源性李斯特菌病的病原体,在免疫力低下的人和动物中能够引起高死亡率.该菌致病的关键是其能在非吞噬细胞发生内化作用并在其中存活.内化素家族蛋白(internalins)在单增李斯特菌感染过程中起着至关重要的作用,该族蛋白是一组以...     

分子伴侣prsA2基因缺失对单增李斯特菌致病性的影响

【目的】构建单增李斯特菌分子伴侣prsA2基因缺失株与回补株，探究其对单增李斯特菌内化素B(InlB)锚定能力以及致病性的影响。【方法】利用穿梭质粒pKSV7和回补质粒pIMK2分别构建prsA2基因缺失株与回补株；通过生长曲线分析亲本株10403S、缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2生长能力；利用Western blotting检测prsA2基因缺失对单增李斯特菌InlB锚定的影响；通过肠上皮细胞(Caco-2)黏附侵袭试验与免疫荧光试验、小鼠毒力试验分析prsA2基因缺失对单增李斯特菌黏附侵袭能力、在宿主细胞间迁移能力及小鼠致病性的影响。【结果】PCR扩增结果显示，试验成功构建了缺失株ΔprsA2和回补株CΔprsA2。生长曲线结果显示，prsA2基因缺失不影响单增李斯特菌在BHI培养基中的生长能力(P>0.05)。Western blotting结果显示，缺失株ΔprsA2细菌表面的InlB锚定量极显著低于10403S和CΔprsA2(P<0.01),细菌培养上清中InlB锚定量极显著高于10403S和CΔprsA2(P<0.01)。细胞试验结果显示，缺失...     

单增李斯特菌lmo0331基因的克隆、序列分析及原核表达

试验旨在对单增李斯特菌临床分离株（LM90SB2）的LPXTG基序表面蛋白lmo0331基因进行克隆、序列分析和原核表达。根据GenBank中lmo0331基因序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增LM90SB2 lmo0331基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,测序后进行核苷酸序列和蛋白结构域分析;构建表达质粒pET32a-0331,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE和Western blotting检测重组蛋白。结果显示,LM90SB2 lmo0331基因核苷酸序列与NTSN株、F2365株、LL195株及WSLC 1033株的同源性均为100.0%,与N2306株、02-1792株、H34株的同源性均为99.9%。LM90SB2 lmo0331基因全长1 956 bp,ORF全长为1 857 bp,共编码618个氨基酸;蛋白结构域预测结果显示,lmo0331蛋白具有NEL、LRR、IR、PulA、LPXTG结构域。SDS-PAGE结果可见约88 ku重组蛋白带,Western blotting表明该蛋白可与小鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性结合。本研究成功构建了原核表达载体pET32a-0331,实现了lmo0331融合蛋白的表达,为进一步研究lmo0331基因的功能及单克隆抗体的制备奠定了基础。     

单增李斯特菌inlK基因缺失株的构建及其生物被膜与消毒剂抗力分析

【目的】 研究inlK基因对Lm90SB2菌株生物被膜形成能力的影响及其生物被膜与消毒剂抗力的关系,以期为有效防控单增李斯特菌污染提供参考。【方法】 以单增李斯特菌Lm90SB2为试验菌,根据GenBank中公布的单增李斯特菌F2365 inlK基因序列(登录号:AE017262),应用Primer Premier 5.0软件设计用于扩增inlK基因上、下游同源臂片段及验证缺失株的特异性引物,以同源重组技术构建inlK基因缺失株,并通过旁外侧引物运用PCR方法进行缺失株检测。将标准菌株Lm90SB2和构建的缺失株分别培养8、12、24、48 h后进行结晶紫染色,在倒置显微镜下观察形态变化,并用酶标仪测定生物被膜形成能力;用含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液作为新洁尔灭消毒剂的中和剂,含5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液和含10 g/L硫代硫酸钠+30 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液84消毒剂的中和剂,设消毒剂+菌悬液、消毒剂+菌悬液+中和剂、中和剂+菌悬液、消毒剂+中和剂+菌悬液、稀释液+菌悬液(阳性对照)、稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)6个试验组,进行中和剂的筛选,并检测不同浓度新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)分别作用1、5、10、20 min时对2株菌的灭菌率。【结果】 PCR结果表明,成功构建了缺失株Lm90SB2ΔinlK,且inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力显著或极显著下降(P<0.05;P<0.01);含3 g/L卵磷脂+3 g/L吐温80的PBS溶液构成的中和剂可有效中和新洁尔灭消毒剂,5 g/L硫代硫酸钠+5 g/L卵磷脂+20 g/L吐温80的PBS溶液可有效中和84消毒剂。不同比例的新洁尔灭(1∶15、1∶30)和84消毒剂(1∶50、1∶100)消毒剂在1、5、10 min对Lm90SB2ΔinlK株的灭菌率均显著或极显著高于Lm90SB2株(P<0.05;P<0.01),且在20 min时灭菌率均为100%。【结论】 inlK基因的缺失导致Lm90SB2菌株生物被膜形成能力下降,且对消毒剂抗力减弱。     

单增李斯特菌双元调控系统lmo1060/lmo1061缺失株的构建及其抗酸应激能力

为了探明双元调控系统Lmo1060/Lmo1061是否影响单增李斯特菌(LM)的抗应激作用及致病性,本研究以LM 10403S为亲本株,通过同源重组技术构建了 Δlmo1060/lmo1061缺失株.应激存活试验结果表明,lmo1060/lmo1061缺失显著增强LM在酸应激(pH=2.5)条件下的存活率,但不影响该菌...     

单增李斯特菌感染并调控宿主丙酰辅酶A羧化酶α(PCCA)的研究

为探究单增李斯特菌感染与宿主丙酰辅酶A羧化酶α (PCCA)表达的相互影响机制,本研究将单增李斯特菌野生株(LM-EGD-e)以MOI 200感染He La细胞5 h后,利用q RT-PCR检测感染LM-EGD-e后HeLa细胞中Pcca基因的转录水平变化,结果显示LM-EGD-e感染HeLa细胞中Pcca基因的转录水平无明显变化(log2FC=-0.305);采用相应试剂盒分别提取感染后的He La细胞蛋白和线粒体蛋白,采用western blot检测PCCA蛋白表达变化,结果显示,LM-EGD-e感染后的HeLa细胞中,以及线粒体中PCCA蛋白表达水平均无显著变化(P>0.05)。PCR扩增Pcca基因后构建p CMV-N-HA-PCCA重组质粒,并经PCR和测序鉴定正确后转染HeLa细胞中过表达PCCA蛋白后,利用q RT-PCR检测HeLa细胞中Pcca基因的转录水平,收集细胞总蛋白采用western blot检测PCCA蛋白表达水平,结果显示,与转染空载体的细胞相比,转染重组质粒的HeLa细胞中Pcca基因的转录水平上调(log2FC=8.454),且细胞内PCCA蛋白...     

环境因子及接种量对单增李斯特菌生长的影响

为探究不同环境因子及接种量对单增李斯特菌（LM90）生长特性的影响,本试验通过测定LM90在各培养条件下的D_600nm值,分析了不同的温度、NaCl浓度、pH,以及温度（0~40℃,梯度为10℃）、NaCl浓度（3%~8%,梯度为1%）、pH （6~9,梯度为1）的交互作用下LM90的生长状况。结果显示,菌株的对数增长期为8~16 h,稳定期为16~20 h,20 h以后进入衰亡期;菌株在NaCl浓度为0.5%~4%时生长良好,其最适生长pH为7.5,最适生长温度为37℃。通过SPSS 20.0软件进行方差分析可知,各因素的交互作用均对LM90有极显著影响（P＜0.01）。本研究为进一步探讨温度、NaCl浓度、pH等因素对LM生长的影响及LM抗环境胁迫的作用机制奠定了基础。